DNA 복구 단백질의 행동의 메커니즘을 조사하기 위해 중지 흐름 속도론 방법의 응용
Summary
Msh2 – Msh6는 DNA의 복제 오류의 복구를 시작 책임이 있습니다. 여기 우리는이 중요한 단백질의 작동 방식 이해 향해 과도 속도론의 접근 방식을 제시한다. 보고서는 결합된 DNA 바인딩과 DNA 수리의 행동의 Msh2 – Msh6 메커니즘을 기본 ATPase의 속도론을 측정하는 정지 흐름 실험을 보여줍니다.
Abstract
이 접근법은 macromolecular 기능을 적용 활성 사이트 농도 및 내장 속도 상수를 포함 기계론의 정보를 산출 이후 과도 운동 분석, 생물 학적 macromolecules의 동작을 이해하는 데 필수입니다. 정상 상태 측정은 전체 촉매 효율과 특이성을 낼 반면, 효소의 경우, 예를 들어, 과도하거나 사전 안정된 상태 측정 식별 및 반응 경로에서 개별 이벤트를 특징. 이러한 단백질 – 단백질 또는 단백질 리간드 상호 작용과 속도 – 제한 conformational 변화에 따라 개별 사건들은 종종 밀리초 timescale 발생하고, 정지 – 흐름과 화학 잃게 흐름 방법으로 직접 측정할 수 있습니다. 이러한 형광으로 광 신호를 감안할 때 중지 흐름은 제품 릴리스 및 촉매 매출 1,2에 바인딩 기판에서 모니터링 반응 진행에 대한 강력하고 접근 도구로 제공하고 있습니다.
여기, 우리는 정지 흐름 속도론의 응용 프로그램 Msh2 – Msh6의 행동의 메커니즘,베이스 – 페어 불일치 및 DNA와 신호 불일치 복구 (MMR) 3-5의 삽입 / 삭제 루프를 인식 진핵세포의 DNA 수리 단백질을 프로브에 신고. 이렇게에 따라서 Msh2 – Msh6 증가 정도의 세 주문 (오류 주파수 ~ 10 -6 to10 -9 기지에서 감소)에 의해 DNA 복제의 정확성하고 게놈 무결성을 유지하는 데 도움이됩니다. 되지 놀랍게도, 결함이있는 인간 Msh2 – Msh6 기능이 유전이 아닌 polyposis 결장암 및 기타 산발적 암 6-8와 연결되어 있습니다. 이 중요 DNA의 신진 대사 단백질의 행동의 메커니즘을 이해하기 위해서, 우리는 일치하지 않는 DNA뿐만 아니라 ATPase 활동과 Msh2 – Msh6 상호 작용의 역학을 탐색하는 연료 MMR에서의 행동. T 불일치 및 모니터링 실시간으로 2 aminopurine의 형광의 발생 증가 : DNA 바인딩은 빠르게 G에 인접한 2 aminopurine (2 – AP = 연합 뉴스) 형광단를 포함하는 DNA와 Msh2 – Msh6를 혼합하여 측정됩니다. T (2 – AP = 연합 뉴스) 레이블이 지정되지 않은 트랩 DNA와 시간 9 이상 형광의 모니터링 감소와 불일치 단지 : DNA 분리는 사전에 형성 Msh2 – Msh6 G를 혼합하여 측정됩니다. 사전 꾸준한 상태 ATPase의 속도론은 7 diethylamino – 3 – ((((2 – maleimidyl) 에틸) 아미노) 카르보닐) coumarin) – 라벨 바인딩 인산염의 인산 바인딩 단백질 (MDCC – PBP) (의 형광의 변화에 의해 측정 PI)는 ATP 가수 분해 9,10 다음 Msh2 – Msh6 발표.
T 불일치와 긴 Msh2 – Msh6 G 형성 : 데이터는 G에 Msh2 – Msh6의 급속한 결합 밝히지 T 복잡한을하는 ATP – 바운드 형태의 단백질이 ATP의 가수 분해 및 안정화의 억제에 차례 결과에 . 반응 속도론은 가설에 대한 명확한 지원을 제공하는 ATP – 바운드 Msh2 – Msh6 신호 이중 나선 구조에 일치하지 않는 기본 쌍을 결합에 DNA 수리가.
F. 노아 비로 및 지에 Zhai 똑같이이 문서에 기여.
Protocol
Discussion
여기에 설명된 DNA 불일치 바인딩 단백질의 예제는 생물 학적 분자의 메커니즘을 연구에 대한 과도 운동 방법의 성능과 유틸리티를 보여줍니다. 단일 매출 시간 규모에서 중지 흐름 측정 일치하지 않는 기본 쌍과 반응 9 긴 단백질 X의 DNA 복합 형성에 Msh2 – Msh6 단백질의 신속하고 구체적인 구속력을 위해 모호하지 않은 증거를 제공했습니다. 또한, ATPase 활동 중단 흐름 (그리고 잃게 흐름) ?…
Acknowledgements
이 작품은 NSF 경력 수상 (MMH), 배리 M. 골드 워터 장학금 (FNB)과 ASBMB 학부 연구 수상 (CWD)에 의해 지원되었다. PBP 이상의 표현에 대한 복제가 친절하게 박사가 마틴 웨브 (MRC, 영국)에 의해 제공되었다.
Materials
| DNA name | Sequence |
| 37 G | 5′- ATT TCC TTC AGC AGA TAT G T A CCA TAC TGA TTC ACA T -3′ |
| 37 T (2-Ap) | 5′- ATG TGA ATC AGT ATG GTA TApT ATC TGC TGA AGG AAA T -3′ |
| 37 T | 5′- ATG TGA ATC AGT ATG GTA T A T ATC TGC TGA AGG AAA T -3′ |
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