DNA Onarım Protein Eylem Mekanizması Soruşturma Durduruldu akış Kinetiği Yöntemleri Uygulama
Summary
Msh2 Msh6 DNA replikasyon hataları tamir başlatmak için sorumludur. İşte bu kritik protein nasıl çalıştığını anlamak yolunda geçici bir kinetiği yaklaşım sunuyoruz. Rapor durdu akış birleştiğinde DNA bağlayıcı ve eylem Msh2-Msh6 DNA onarım mekanizması altında yatan ATPaz kinetiği ölçmek için deneyler göstermektedir.
Abstract
Bu yaklaşımın mekanistik bilgi makromoleküler fonksiyonu yöneten etkin sitenin konsantrasyonları ve içsel hız sabitleri dahil verimleri beri Geçici kinetik analizi, biyolojik makromoleküllerin işleyişini anlamak için vazgeçilmez bir unsurdur. Kararlı durum ölçümleri, sadece genel katalitik verimliliği ve özgünlüğü verimi ise, enzimler durumda, örneğin, geçici ya da önceden istikrarlı bir devlet ölçümleri tanımlamak ve reaksiyon yolu bireysel olayları karakterize. Bireysel, protein-protein ya da protein-ligand etkileşimleri ve hız sınırlayıcı yapı değişiklikleri gibi olaylar sık sık milisaniyelik zaman ölçeğinde meydana gelen ve durdu akışı ve kimyasal quench akış yöntemleri ile doğrudan ölçülebilir. Gibi floresan gibi bir optik sinyal durdu akış ürün sürümü ve katalitik cirosu 1,2 bağlayıcı substrat izleme tepki ilerleme için güçlü ve ulaşılabilir bir araç olarak hizmet vermektedir .
Burada, durdu akış kinetiği uygulama Msh2-Msh6 etki mekanizması, baz çifti uyumsuzlukları ve DNA ve sinyalleri uyumsuzluğu onarım (MMR) 3-5 ekleme / silme döngüleri tanıyan bir ökaryotik DNA onarım protein prob rapor. Bunu yaparken, böylece Msh2 Msh6 büyüklükte üç siparişleri (~ 10 -6 to10 -9 üsleri hata sıklığı azalır) DNA replikasyonu doğruluğunu artırır ve genomik bütünlüğünü korumaya yardımcı olur . Beklendiği gibi, insan kusurlu Msh2-Msh6 fonksiyonu kalıtsal non-polipozis kolon kanseri ve diğer sporadik kanserler 6-8 ile ilişkilidir. Bu kritik DNA metabolik protein eylem mekanizmasını anlamak için, eşleşmeyen DNA gibi ATPaz aktivitesi Msh2 Msh6 etkileşim dinamikleri problama yakıtlar MMR olarak eylemler. T uyumsuzluğu ve izleme, gerçek zamanlı olarak 2-aminopurine floresan ortaya çıkan artış: DNA bağlayıcı G bitişik 2-aminopurine (2-Ap) fluorofor içeren DNA ile hızla Msh2-Msh6 karıştırma ile ölçülür. T (2-Ap) etiketsiz tuzak DNA ve izleme süresi 9 üzerinde floresan azalma ile uyumsuzluğu kompleksi: DNA disosiasyon önceden oluşmuş Msh2-Msh6 G karıştırılarak ölçülür. Pre-kararlı durum ATPaz kinetiği 7-diethylamino-3-((((2-maleimidyl) etil) amino) karbonil) kumarin) etiketli bağlayıcı fosfat Fosfat Bağlayıcı Protein (MDCC-PBP) (floresan değişimi ile ölçülür Pi) ATP hidrolizi 9,10 Msh2-Msh6 tarafından yayınlandı.
T uyumsuzluğu ve oluşumu uzun ömürlü bir Msh2-Msh6 G: Bu veriler G Msh2-Msh6 hızlı bağlanma ortaya T kompleksi bağlı bir ATP şeklinde proteinin ATP hidroliz ve istikrar baskılanması teslim sonuçları . Reaksiyon kinetiği hipotez için açık destek sağlayan ATP bağlı Msh2 Msh6 sinyaller uyumsuz bir baz çifti bağlayıcı çift sarmal DNA onarım.
F. Nuh Biro ve Jie Zhai Bu çalışmada eşit katkıda bulunmuştur.
Protocol
Discussion
Burada açıklanan DNA uyumsuzluğu bağlayıcı protein örneği, biyolojik moleküllerin mekanizmaları çalışmak için geçici kinetik yöntemler ve yardımcı güç göstermektedir. Tek ciro zaman ölçekte Durduruldu akış ölçümleri, uyumsuz bir baz çifti ve reaksiyon 9 uzun ömürlü bir protein X DNA kompleksi oluşumu Msh2-Msh6 protein hızlı ve belirli bağlayıcı için net bir kanıt sağladı. Ayrıca, ATPaz aktivitesi durdu akışı (ve quench akış) analizi, eşleşmeyen DNA bağla…
Acknowledgements
Bu çalışma, bir NSF KARİYER Ödülü (MMH), Barry M. Goldwater bursu (FNB) ve ASBMB Lisans Araştırma Ödülü (CWD) tarafından desteklenmiştir. PBP, ifade için klon lütfen Dr. Martin Webb (MRC, UK) tarafından sağlanmıştır.
Materials
| DNA name | Sequence |
| 37 G | 5′- ATT TCC TTC AGC AGA TAT G T A CCA TAC TGA TTC ACA T -3′ |
| 37 T (2-Ap) | 5′- ATG TGA ATC AGT ATG GTA TApT ATC TGC TGA AGG AAA T -3′ |
| 37 T | 5′- ATG TGA ATC AGT ATG GTA T A T ATC TGC TGA AGG AAA T -3′ |
References
- Johnson, K. A. Advances in transient-state kinetics. Curr Opin Biotechnol. 9 (1), 87-89 (1998).
- Johnson, K. A. E. . Kinetic analysis of macromolecules. , (2003).
- Obmolova, G., Ban, C., Hsieh, P., Yang, W. Crystal structures of mismatch repair protein MutS and its complex with a substrate DNA. Nature. 407 (6805), 703-710 (2000).
- Lamers, M. H. The crystal structure of DNA mismatch repair protein MutS binding to a G x T mismatch. Nature. 407 (6805), 711-717 (2000).
- Warren, J. J. Structure of the human MutSalpha DNA lesion recognition complex. Mol Cell. 26 (4), 579-592 (2007).
- Kunkel, T. A. &. a. m. p. ;. a. m. p., Erie, D. A. . DNA Mismatch Repair. Annu Rev Biochem. 74, 681-710 (2005).
- Jiricny, J. The multifaceted mismatch-repair system. Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (5), 335-346 (2006).
- Hsieh, P., Yamane, K. DNA mismatch repair: Molecular mechanism, cancer, and ageing. Mech Ageing Dev. 129 (7-8), 391-407 (2008).
- Jacobs-Palmer, E., Hingorani, M. M. The effects of nucleotides on MutS-DNA binding kinetics clarify the role of MutS ATPase activity in mismatch repair. J Mol Biol. 366 (4), 1087-1098 (2007).
- Antony, E., Khubchandani, S., Chen, S., Hingorani, M. M., M, M. Contribution of Msh2 and Msh6 subunits to the asymmetric ATPase and DNA mismatch binding activities of Saccharomyces cerevisiae Msh2-Msh6 mismatch repair protein. DNA Repair (Amst). 5 (2), 153-162 (2006).
- Antony, E., Hingorani, M. M. Mismatch recognition-coupled stabilization of Msh2-Msh6 in an ATP-bound state at the initiation of DNA repair. 생화학. 42 (25), 7682-7693 (2003).
- Finkelstein, J., Antony, E., Hingorani, M. M., O’Donnell, M. Overproduction and analysis of eukaryotic multiprotein complexes in Escherichia coli using a dual-vector strategy. Anal Biochem. 319 (1), 78-87 (2003).
- Zhai, J., Hingorani, M. M. S. cerevisiae Msh2-Msh6 DNA binding kinetics reveal a mechanism of targeting sites for DNA mismatch repair. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (2), 680-685 (2010).
- Brune, M., Hunter, J. L., Corrie, J. E., Webb, M. R. Direct, real-time measurement of rapid inorganic phosphate release using a novel fluorescent probe and its application to actomyosin subfragment 1 ATPase. 생화학. 33 (27), 8262-8271 (1994).
- Brune, M. Mechanism of inorganic phosphate interaction with phosphate binding protein from Escherichia coli. 생화학. 37 (29), 10370-10380 (1998).
- Antony, E., Hingorani, M. M. Asymmetric ATP binding and hydrolysis activity of the Thermus aquaticus MutS dimer is key to modulation of its interactions with mismatched DNA. 생화학. 43 (41), 13115-13128 (2004).
- Gradia, S., Acharya, S., Fishel, R. The human mismatch recognition complex hMSH2-hMSH6 functions as a novel molecular switch. Cell. 91 (7), 995-1005 (1997).
- Mazur, D. J., Mendillo, M. L., Kolodner, R. D., D, R. Inhibition of Msh6 ATPase activity by mispaired DNA induces a Msh2(ATP)-Msh6(ATP) state capable of hydrolysis-independent movement along DNA. Mol Cell. 22 (1), 39-49 (2006).
