Microdissection laser appliquée au profil d'expression génique de la Sous-ensemble de cellules provenant de la Drosophile Wing disque

Summary

Microdissection laser a été appliquée pour analyser les profils d'expression génique dans des compartiments spécifiques de la drosophile aile disque soumis à localisées ARNi<em> In vivo</em>. ARN extrait de zones équivalentes des compartiments silence et unsilenced a été analysée par RT-PCR quantitative pour déterminer comparative profil d'expression génique dans le cadre de microécologie tissu natif.

Abstract

Nature hétérogène des tissus s'est avérée être un facteur limitant dans la quantité d'informations qui peuvent être générés à partir d'échantillons biologiques, ce qui compromet les analyses en aval. Considérant les associations complexes et dynamiques cellulaires existant dans de nombreux tissus, afin de récapituler les interactions in vivo analyse approfondie moléculaires on doit être capable d'analyser les populations cellulaires spécifiques au sein de leur contexte d'origine. Laser à médiation microdissection pouvons atteindre cet objectif, permettant l'identification non ambiguë et bonne récolte de cellules d'intérêt sous visualisation microscopique direct tout en conservant l'intégrité moléculaire. Nous avons appliqué cette technologie pour analyser l'expression génique dans des zones définies du disque de développement chez la drosophile aile, ce qui représente un système modèle avantageux pour étudier le contrôle de croissance, la différenciation cellulaire et l'organogenèse. Larves disques imaginaux sont précocement subdivisé en compartiments antérieur et postérieur, dorsale et ventrale par des frontières restriction lignée. Faisant usage de l'inductible GAL4 UAS-système d'expression binaire, chacun de ces compartiments peuvent être spécifiquement étiquetés mouches transgéniques exprimant un transgène UAS-GFP sous le contrôle du pilote approprié GAL4-construire. Dans les disques transgéniques, le profilage d'expression génique de sous-ensembles distincts de cellules peut être précisément déterminé après microdissection laser médiation, en utilisant le signal GFP fluorescentes pour guider découpées au laser.

Parmi la variété d'applications en aval, nous nous sommes concentrés sur les profils de transcription ARN après localisée interférence ARN (ARNi). Avec l'avènement de l'ARNi de la technologie, la GFP étiquetage peut être couplé avec knockdown localisée d'un gène donné, permettant pour déterminer la réponse transcriptionnelle d'une population cellulaire discrète à l'inactivation des gènes spécifiques. Afin de valider cette approche, nous disséqué zones équivalentes du disque de la partie postérieure (marqué par l'expression de GFP), et la partie antérieure (sans étiquette) du compartiment à faire taire régionale dans le compartiment d'un gène P contraire exprimée de manière ubiquitaire. L'ARN a été extrait de microdissection des zones réduites au silence et unsilenced et comparative du profil d'expression génique déterminé par quantitative en temps réel RT-PCR. Nous montrons que cette méthode peut être effectivement appliquée pour la transcriptomique précise des sous-ensembles de cellules au sein des disques imaginaux chez la drosophile. En effet, tandis que la préparation du disque massifs comme source d'ARN suppose généralement l'homogénéité des cellules, il est bien connu que l'expression transcriptionnelle peut varier considérablement au sein de ces structures à la suite d'informations de position. En utilisant le signal GFP fluorescentes localisées au guide de coupe au laser, plus précis analyses transcriptionnelles peuvent être réalisées et rentable appliqué à des applications disparates, y compris les profils de transcription des lignées cellulaires distinctes au sein de leur contexte d'origine.

Protocol

Partie 1. Préparation de disques drosophile Wing Imaginal Soumis à l'ARNi spécifiques et localisées. Comme matériel biologique, nous avons utilisé des disques imaginaux aile drosophile obtenue à partir de larves transgéniques soumises à l'inactivation des gènes localisés et spécifiques par le biais du système GAL4/UAS 1. Cette descendance larvaire orginates d'un croisement génétique impliquant deux lignées parentales: l'un portant le…

Discussion

En ce qui concerne leurs niveaux d'expression basale réalisés dans les compartiments antérieur / postérieur de l'aile unsilenced disques, l'activité du gène X sélectionnés a été trouvée réduite à 40% à faire taire. En revanche, une de ses cibles putatives (gènes Y) a été trouvée significativement régulée à la hausse (7 fois-augmentation), nous conduit à valider l'hypothèse qu'il était régulé négativement par le gène X.

Nous concluons que l'…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
DEPC water		Sigma	W4502
RNase Zap		Sigma	R2020
TRI Reagent		Sigma	T9424
SuperScript III		Invitrogen	18080093
Master Mix		Invitrogen	11761100
Agarose		Sigma	A9539
Isopropyl alcohol		Sigma	I9516
Chloroform		Sigma	C7559
Dream taq		Fermentas	EP0701

Fly strains

Drosophila UAS-silencing lines can be obtained from VDRC RNAi collection ². A collection of GAL4-driver lines is available at the Bloomington Drosophila Stock Center (Indiana, USA).

Equipment

Required equipment includes Laser microdissector (Leica LMD6000), Coulter Microfuge 22R (Beckman), PCR (BIO-RAD My Cycler), Real Time PCR (BIO-RAD iQ5).

Tools

Required tools include: glass wells, brush, microdissection forceps, hanging drop slides, insect pins mounted on syringe needles, metal frames with PET membrane, plastic tubes (50 ml, 05 ml, 0.25 ml).