Microdisección láser aplicada a perfiles de expresión génica de subconjunto de las células de la Drosophila Ala Disco

Summary

Microdisección láser se aplicó para analizar perfiles de expresión génica en compartimentos específicos de Drosophila disco ala sometida a localizado RNAi<em> In vivo</em>. ARN extraído de las áreas equivalentes de los compartimentos de silencio y sin silenciador fue analizada por RT-PCR cuantitativa para determinar perfiles de expresión genética comparada en el contexto de microecología tejido nativo.

Abstract

Naturaleza heterogénea de los tejidos ha demostrado ser un factor limitante en la cantidad de información que puede ser generada a partir de muestras biológicas, lo que compromete los análisis. Teniendo en cuenta las asociaciones celulares complejos y dinámicos que existen en muchos tejidos, con el fin de recapitular las interacciones in vivo el análisis molecular a fondo uno debe ser capaz de analizar poblaciones específicas de células dentro de su contexto de origen. Laser mediada por microdisección puede lograr este objetivo, lo que permite identificar de forma inequívoca y exitosa cosecha de las células de interés bajo visualización microscópica directa, manteniendo la integridad molecular. Hemos aplicado esta tecnología para analizar la expresión de genes dentro de áreas definidas del desarrollo del disco ala de Drosophila, lo que representa un modelo de sistema ventajoso para estudiar el control del crecimiento, la diferenciación celular y la organogénesis. Larval discos imaginales se subdivide en compartimentos precozmente anterior y posterior, dorsal y ventral de los límites de restricción de linaje. Haciendo uso de la inducible GAL4-UAS sistema de expresión binaria, cada uno de estos compartimentos pueden ser etiquetados específicamente en las moscas transgénicas que expresan un transgén UAS-GFP bajo el control de la adecuada GAL4 conductor de construcción. En los discos de transgénicos, perfiles de expresión génica de los subconjuntos de células discretas precisamente puede determinarse después de láser mediada por microdisección, utilizando la señal de GFP fluorescentes para guía de corte por láser.

Entre la variedad de aplicaciones posteriores, nos centramos en perfiles de transcripción del ARN después de localizada la interferencia de ARN (RNAi). Con el advenimiento de la tecnología del RNAi, las buenas prácticas agrarias de etiquetado puede ir acompañado de caída localizada de un gen determinado, lo que permite determinar la respuesta transcripcional de una población de células discretas para el silenciamiento de genes específicos. Para validar este enfoque, hemos diseccionado áreas equivalentes del disco desde la parte posterior (marcado por la expresión de GFP), y la anterior (sin etiqueta) en compartimiento de silenciar regional en el compartimiento de P de un gen de otro modo de expresión ubicua. Se extrajo el ARN de microdissected áreas silenciadas y sin silenciador y el perfil comparativo de la expresión de genes determinados por cuantitativa en tiempo real RT-PCR. Se demuestra que este método se puede aplicar con eficacia para la transcriptómica precisa de los subconjuntos de células dentro de los discos imaginales de Drosophila. En efecto, mientras que la preparación del disco masiva como fuente de ARN en general, supone homogeneidad de la célula, es bien sabido que la expresión de la transcripción puede variar mucho dentro de estas estructuras como consecuencia de la información de posición. Utilizando la señal fluorescente GFP localizada a guía de corte por láser, los análisis de la transcripción más precisa se puede realizar y rentable aplicado a diferentes aplicaciones, incluyendo perfiles de transcripción de los distintos linajes de células dentro de su contexto de origen.

Protocol

Parte 1. Preparación de los discos imaginal del ala de Drosophila Sometido a RNAi específico y localizado. Como material biológico, que utiliza discos imaginal del ala de Drosophila obtenida a partir de larvas transgénicas sometidas a la silenciamiento de los genes localizados y específicos por medio del sistema de GAL4/UAS 1. Esta progenie larval orginates de un cruce genético asociado con las dos líneas parentales: uno que lleva el conductor GAL4, la segun…

Discussion

Con respecto a sus niveles de expresión basal logrado en los compartimentos anterior / posterior de los discos del ala sin silenciador, la actividad del gen X seleccionados se encuentran reducidos al 40% en silencio. Por el contrario, uno de sus supuestos objetivos (genes Y) se encontró significativamente hasta reguladas (7 veces de aumento), que nos lleva a validar la hipótesis de que fue regulada negativamente por el gen X.

Llegamos a la conclusión de que el enfoque descrito anteriorme…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
DEPC water		Sigma	W4502
RNase Zap		Sigma	R2020
TRI Reagent		Sigma	T9424
SuperScript III		Invitrogen	18080093
Master Mix		Invitrogen	11761100
Agarose		Sigma	A9539
Isopropyl alcohol		Sigma	I9516
Chloroform		Sigma	C7559
Dream taq		Fermentas	EP0701

Fly strains

Drosophila UAS-silencing lines can be obtained from VDRC RNAi collection ². A collection of GAL4-driver lines is available at the Bloomington Drosophila Stock Center (Indiana, USA).

Equipment

Required equipment includes Laser microdissector (Leica LMD6000), Coulter Microfuge 22R (Beckman), PCR (BIO-RAD My Cycler), Real Time PCR (BIO-RAD iQ5).

Tools

Required tools include: glass wells, brush, microdissection forceps, hanging drop slides, insect pins mounted on syringe needles, metal frames with PET membrane, plastic tubes (50 ml, 05 ml, 0.25 ml).