ثنائي الفوتون المستندة إلى تنشيط ضوئي في الأجنة الحية اسماك الزرد
Summary
Multiphoton المجهري يسمح السيطرة على الفوتونات منخفضة الطاقة الضوئية مع الاختراق العميق والضيائية مخفضة. نحن تصف استخدام هذه التكنولوجيا لوضع العلامات الخلية تعيش في الأجنة الزرد. يمكن أن يكون هذا البروتوكول تكييفها بسهولة للتحريض ، صورة من الجزيئات التي تستجيب للضوء مختلف.
Abstract
وقد ثبت تنشيط ضوئي من المركبات المستهدفة في الكائنات الحية نهجا قيما للتحقيق في العمليات البيولوجية المختلفة مثل التطور الجنيني ، مما يشير الخلوية وعلم وظائف الأعضاء الكبار. في هذا الصدد ، واستخدام متعدد الفوتون المجهري تمكن من تنشيط ضوئي الكمي وكيل معين تستجيب الضوء في الأنسجة العميقة في قرار خلية واحدة. كما الأجنة الزرد شفافة بصريا ، ويمكن رصد تنميتها في الجسم الحي. هذه الصفات تجعل من الزرد كائن نموذج مثالي للسيطرة على نشاط مجموعة متنوعة من العوامل الكيميائية والبروتينات التي تركز الضوء. نحن هنا وصف استخدام المجهر ثنائي الفوتون للحث على تنشيط فلوريسئين قفص كيميائيا ، والذي بدوره يسمح لنا لمتابعة مصير الخلايا في الأجنة الزرد حية. نحن نستخدم تعبير عن أجنة حية المعالم الوراثية (GFP) لتحديد الهدف بدقة وأية خلايا من الفائدة. ويمكن استخدام هذا الإجراء على نحو مماثل لتفعيل دقيقة بفعل ضوء البروتينات والهرمونات والجزيئات الصغيرة وغيرها من المركبات في قفص.
Protocol
Discussion
الصور activatable المركبات هي عبارة عن جزيئات وظيفتها حتى تضاء ملثمين كانوا مع طول موجة معينة (وعادة ما فوق البنفسجية) ، الأمر الذي أدى إلى تفاعل كيميائي ضوئي يحول جزيئات في حالة نشطة بيولوجيا أو كيميائيا. هذه المجسات توفر أدوات قوية جدا في مجال البحث بيولوجيا الخلايا ، حي?…
Acknowledgements
بفضل من المقرر أن برودسكي جينيا للرسومات الشكل ؛ فياتشيسلاف Kalchenko ، لوتز دوغلاس ، وليونيد رويتمان للحصول على المشورة والمساعدة التقنية مع uncaging اثنين الفوتون ؛ مايان Tahor وسليمان Elsadin للحصول على المساعدة التقنية ؛ أوفه Strahle لتوفير خط يرجى مراسلة وneurogenin1 عاموس Gutnick للتعليقات على هذه المخطوطة. ويدعم البحوث في المختبر Levkowitz من المؤسسة الألمانية الإسرائيلية (منحة رقم 183 / 2007) ؛ إسرائيل مؤسسة العلوم (منحة رقم 928/08) وهارييت ومارسيل ديكر مؤسسة. GL هو شاغل والتنمية تاورو الرئاسة شهادة في مجال البحوث الطبية الحيوية.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Dextran-conjugated 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl (DMNB) caged fluorescein (10,000 MW dextran, anionic) | Invitrogen | D-3310 | molecular probes | |
| Agarose for injection trough and coated plates | Sigma | A9539 | ||
| Thin Wall Glass Capillaries with filament | World Precision Instruments | TW100F-6 | ||
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | ||
| Microloader tip | Eppendorf | 5242 956.003 | ||
| Pneumatic picopump | World Precision Instruments | PV820 | ||
| Phenylthiourea (PTU) | Sigma | 22290-9 | ||
| Low melting point agarose for embryo mounting | Ultra Pure LMP agarose | 16520100 | ||
| Anti-Fluorescein- alkaline phosphatase (AP) Fab fragments | Roche | 11426338910 | ||
| Fast Red | Roche | 11496549001 |
References
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Brachydanio rerio. , (1995).
- Russek-Blum, N., Nabel-Rosen, H., Levkowitz, G. High resolution fate map of the zebrafish diencephalon. Dev Dyn. 238, 1827-1835 (2009).
- Russek-Blum, N. Dopaminergic neuronal cluster size is determined during early forebrain patterning. Development. 135, 3401-3413 (2008).
- Kozlowski, D. J., Murakami, T., Ho, R. K., Weinberg, E. S. Regional cell movement and tissue patterning in the zebrafish embryo revealed by fate mapping with caged fluorescein. Biochem Cell Biol. 75, 551-562 (1997).
- Staudt, N., Houart, C. The Prethalamus Is Established during Gastrulation and Influences Diencephalic Regionalization. PLoS Biol. 5, e69-e69 (2007).
- Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 12651-12656 (2002).
- Hatta, K., Tsujii, H., Omura, T. Cell tracking using a photoconvertible fluorescent protein. Nat Protoc. 1, 960-967 (2006).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).
- Bulina, M. E. Chromophore-assisted light inactivation (CALI) using the phototoxic fluorescent protein KillerRed. Nat Protoc. 1, 947-9453 (2006).
- Adams, S. R., Tsien, R. Y. Controlling cell chemistry with caged compounds. Annu Rev Physiol. 55, 755-784 (1993).
- Wieboldt, R. Photolabile precursors of glutamate: synthesis, photochemical properties, and activation of glutamate receptors on a microsecond time scale. Proc Natl Acad Sci U S A. 91, 8752-8756 (1994).
- Marque, J. J. Using caged neurotransmitters. Nature. 337, 583-584 (1989).
- Zucker, R. Photorelease techniques for raising or lowering intracellular Ca2. Methods Cell Biol. 40, 31-63 (1994).
- Neveu, P. A caged retinoic acid for one- and two-photon excitation in zebrafish embryos. Angew Chem Int Ed Engl. 47, 3744-3746 (2008).
- Shestopalov, I. A., Sinha, S., Chen, J. K. Light-controlled gene silencing in zebrafish embryos. Nat Chem Biol. 3, 650-651 (2007).
- Ando, H., Furuta, T., Tsien, R. Y., Okamoto, H. Photo-mediated gene activation using caged RNA/DNA in zebrafish embryos. Nat Genet. 28, 317-325 (2001).
