Zwei-Photonen-Based Photoaktivierung in Live Zebrafischembryonen
Summary
Mehrphotonenmikroskopie ermöglicht die Steuerung von Photonen niedriger Energie mit tiefen optischen Durchbruch und geringere Phototoxizität. Wir beschreiben den Einsatz dieser Technologie für Live-Cell-Kennzeichnung in Zebrafisch-Embryonen. Dieses Protokoll kann leicht für die Foto-Induktion verschiedener Licht-responsive Moleküle angepasst werden.
Abstract
Photoaktivierung von Zielverbindungen in einem lebenden Organismus hat ein wertvoller Ansatz erwiesen, um verschiedene biologische Prozesse wie der embryonalen Entwicklung, zelluläre Signalwege und Erwachsenen Physiologie zu untersuchen. In dieser Hinsicht ermöglicht die Verwendung von Multi-Photonen-Mikroskopie quantitative Photoaktivierung von einem bestimmten Licht reagieren Agenten in tiefe Gewebe auf einer einzigen Zelle Auflösung. Als Zebrafischembryonen optisch transparent sind, kann ihre Entwicklung in vivo beobachtet werden. Diese Eigenschaften machen den Zebrafisch einen perfekten Modell-Organismus für die Steuerung der Aktivität einer Vielzahl von chemischen Stoffen und Proteine, die durch konzentriertes Licht. Hier beschreiben wir den Einsatz von Zwei-Photonen-Mikroskopie, um die Aktivierung von chemisch Käfig Fluorescein, was wiederum ermöglicht es uns, Zell-Schicksal in lebenden Zebrafisch-Embryonen folgen zu induzieren. Wir verwenden Embryonen Ausdruck einer Live-genetische Wahrzeichen (GFP) zu lokalisieren und zielgenauer alle Zellen von Interesse. Dieses Verfahren kann in ähnlicher Weise für präzise Licht induzierte Aktivierung von Proteinen, Hormonen, kleinen Molekülen und anderen Käfig-Verbindungen verwendet werden.
Protocol
Discussion
Foto-aktivierbaren Verbindungen sind Moleküle, deren Funktion es ist maskiert, bis sie mit einer bestimmten Wellenlänge (in der Regel UV), induzieren eine photochemische Reaktion, dass die Moleküle umgewandelt in eine biologisch oder chemisch aktiven Zustand sind beleuchtet. Diese Sonden liefern eine sehr mächtige Werkzeuge in der zellbiologischen Forschung, da die Aktivierung genau gesteuert werden zeitlich und räumlich durch die Begrenzung ihrer Belichtung.
Der wesentliche Vorteil der…
Acknowledgements
Dank gebührt Genia Brodsky für Bild-Grafikprozessor; Vyacheslav Kalchenko, Douglas Lutz, und Leonid Roitman für technische Beratung und Unterstützung bei der Zwei-Photonen-Uncaging; Maayan Tahor und Suliman Elsadin für technische Hilfe, Uwe Strähle für die freundliche Bereitstellung der neurogenin1 Reporter Linie und Amos Gutnick für Kommentare zu diesem Manuskript. Israel Science Foundation (Grant-Nummer 928/08) und die Harriet & Marcel Dekker Foundation; Die Forschung in der Levkowitz Labor wird durch die Deutsch-Israelische Stiftung (Förderkennzeichen 183/2007) unterstützt. GL ist ein Inhaber des Tauro Career Development Lehrstuhls für Biomedizinische Forschung.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Dextran-conjugated 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl (DMNB) caged fluorescein (10,000 MW dextran, anionic) | Invitrogen | D-3310 | molecular probes | |
| Agarose for injection trough and coated plates | Sigma | A9539 | ||
| Thin Wall Glass Capillaries with filament | World Precision Instruments | TW100F-6 | ||
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | ||
| Microloader tip | Eppendorf | 5242 956.003 | ||
| Pneumatic picopump | World Precision Instruments | PV820 | ||
| Phenylthiourea (PTU) | Sigma | 22290-9 | ||
| Low melting point agarose for embryo mounting | Ultra Pure LMP agarose | 16520100 | ||
| Anti-Fluorescein- alkaline phosphatase (AP) Fab fragments | Roche | 11426338910 | ||
| Fast Red | Roche | 11496549001 |
References
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