दो फोटॉन आधारित लाइव Zebrafish भ्रूण में photoactivation
Summary
माइक्रोस्कोपी multiphoton गहरी ऑप्टिकल पैठ और कम phototoxicity के साथ कम ऊर्जा photons के नियंत्रण की अनुमति देता है. हम zebrafish भ्रूण में रहते सेल लेबलिंग के लिए इस प्रौद्योगिकी के उपयोग का वर्णन. यह प्रोटोकॉल विभिन्न प्रकाश उत्तरदायी अणुओं की तस्वीर शामिल होने के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है.
Abstract
एक जीवित जीव में लक्ष्य यौगिकों के photoactivation एक मूल्यवान दृष्टिकोण साबित हो गया है भ्रूण के विकास, सेलुलर संकेत और वयस्क शरीर क्रिया विज्ञान के रूप में विभिन्न जैविक प्रक्रियाओं की जांच. इस संबंध में, बहु photon माइक्रोस्कोपी का उपयोग किसी दिए गए किसी एकल कक्ष के संकल्प पर प्रकाश गहरी ऊतकों में उत्तरदायी एजेंट के मात्रात्मक photoactivation सक्षम बनाता है. Zebrafish भ्रूण के रूप में ऑप्टिकली पारदर्शी होते हैं, उनके विकास में vivo नजर रखी जा सकता है. ये लक्षण zebrafish केंद्रित प्रकाश द्वारा रासायनिक एजेंटों और प्रोटीन की एक किस्म की गतिविधि को नियंत्रित करने के लिए एक आदर्श मॉडल जीव बनाते हैं. यहाँ हम दो photon माइक्रोस्कोपी उपयोग करने के लिए fluorescein रासायनिक बंदी, जो बारी में हमें जीना zebrafish भ्रूण में सेल भाग्य का पालन करने के लिए अनुमति देता है के सक्रियण प्रेरित वर्णन. हम एक जीने आनुवंशिक ऐतिहासिक (GFP) व्यक्त हित के किसी भी कक्ष को खोजने के लिए और ठीक लक्ष्य भ्रूण का उपयोग करें. यह प्रक्रिया इसी तरह प्रोटीन, हार्मोन, छोटे अणुओं और अन्य बंदी यौगिकों के सटीक प्रकाश प्रेरित सक्रियण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Protocol
Discussion
फोटो activatable यौगिकों अणुओं समारोह जिसका नकाबपोश जब तक वे एक विशिष्ट तरंग दैर्ध्य (आमतौर पर यूवी), एक प्रकाश रासायनिक प्रतिक्रिया है कि एक जैविक या रासायनिक रूप से सक्रिय राज्य में अणुओं धर्मान्तरित उत्प्…
Acknowledgements
धन्यवाद आंकड़ा ग्राफ़िक्स के लिए Genia Brodsky कारण हैं, व्याचेस्लाव Kalchenko, डगलस Lutz, और तकनीकी सलाह और दो photon uncaging के साथ सहायता के लिए लियोनिद Roitman, Maayan Tahor और तकनीकी सहायता के लिए Suliman Elsadin, Uwe Strahle कृपया neurogenin1 संवाददाता लाइन प्रदान करने के लिए अमोस Gutnick इस पांडुलिपि पर टिप्पणियों के लिए. इसराइल विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान संख्या 928/08) और हेरिएट और मार्सेल डेकर फाउंडेशन; Levkowitz प्रयोगशाला में अनुसंधान जर्मन – इजरायल फाउंडेशन (अनुदान संख्या 183/2007) के द्वारा समर्थित है. जीएल Tauro कैरियर विकास चेयर जैव चिकित्सा अनुसंधान में एक अवलंबी है.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Dextran-conjugated 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl (DMNB) caged fluorescein (10,000 MW dextran, anionic) | Invitrogen | D-3310 | molecular probes | |
| Agarose for injection trough and coated plates | Sigma | A9539 | ||
| Thin Wall Glass Capillaries with filament | World Precision Instruments | TW100F-6 | ||
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | ||
| Microloader tip | Eppendorf | 5242 956.003 | ||
| Pneumatic picopump | World Precision Instruments | PV820 | ||
| Phenylthiourea (PTU) | Sigma | 22290-9 | ||
| Low melting point agarose for embryo mounting | Ultra Pure LMP agarose | 16520100 | ||
| Anti-Fluorescein- alkaline phosphatase (AP) Fab fragments | Roche | 11426338910 | ||
| Fast Red | Roche | 11496549001 |
References
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Brachydanio rerio. , (1995).
- Russek-Blum, N., Nabel-Rosen, H., Levkowitz, G. High resolution fate map of the zebrafish diencephalon. Dev Dyn. 238, 1827-1835 (2009).
- Russek-Blum, N. Dopaminergic neuronal cluster size is determined during early forebrain patterning. Development. 135, 3401-3413 (2008).
- Kozlowski, D. J., Murakami, T., Ho, R. K., Weinberg, E. S. Regional cell movement and tissue patterning in the zebrafish embryo revealed by fate mapping with caged fluorescein. Biochem Cell Biol. 75, 551-562 (1997).
- Staudt, N., Houart, C. The Prethalamus Is Established during Gastrulation and Influences Diencephalic Regionalization. PLoS Biol. 5, e69-e69 (2007).
- Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 12651-12656 (2002).
- Hatta, K., Tsujii, H., Omura, T. Cell tracking using a photoconvertible fluorescent protein. Nat Protoc. 1, 960-967 (2006).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).
- Bulina, M. E. Chromophore-assisted light inactivation (CALI) using the phototoxic fluorescent protein KillerRed. Nat Protoc. 1, 947-9453 (2006).
- Adams, S. R., Tsien, R. Y. Controlling cell chemistry with caged compounds. Annu Rev Physiol. 55, 755-784 (1993).
- Wieboldt, R. Photolabile precursors of glutamate: synthesis, photochemical properties, and activation of glutamate receptors on a microsecond time scale. Proc Natl Acad Sci U S A. 91, 8752-8756 (1994).
- Marque, J. J. Using caged neurotransmitters. Nature. 337, 583-584 (1989).
- Zucker, R. Photorelease techniques for raising or lowering intracellular Ca2. Methods Cell Biol. 40, 31-63 (1994).
- Neveu, P. A caged retinoic acid for one- and two-photon excitation in zebrafish embryos. Angew Chem Int Ed Engl. 47, 3744-3746 (2008).
- Shestopalov, I. A., Sinha, S., Chen, J. K. Light-controlled gene silencing in zebrafish embryos. Nat Chem Biol. 3, 650-651 (2007).
- Ando, H., Furuta, T., Tsien, R. Y., Okamoto, H. Photo-mediated gene activation using caged RNA/DNA in zebrafish embryos. Nat Genet. 28, 317-325 (2001).
