Due-Photon-Based fotoattivazione in Live embrioni di zebrafish
Summary
Microscopia multiphoton permette il controllo di fotoni a bassa energia con profonda penetrazione ottica e fototossicità ridotto. Descriviamo l'uso di questa tecnologia per l'etichettatura delle cellule vive in embrioni di zebrafish. Questo protocollo può essere facilmente adattato per foto-induzione di varie molecole di luce-sensibile.
Abstract
Fotoattivazione di composti target in un organismo vivente si è dimostrato un valido approccio per studiare vari processi biologici quali lo sviluppo embrionale, segnalazione cellulare e la fisiologia adulta. A questo proposito, l'uso del multi-fotone microscopia permette fotoattivazione quantitativa di un dato agente luce reattivo nei tessuti profondi con una risoluzione singola cella. Come embrioni di zebrafish sono otticamente trasparenti, il loro sviluppo può essere monitorata in vivo. Queste caratteristiche rendono il pesce zebra un organismo modello perfetto per controllare l'attività di una varietà di agenti chimici e le proteine dalla luce concentrata. Qui si descrivono l'uso della microscopia a due fotoni per indurre l'attivazione di chimicamente in gabbia fluoresceina, che a sua volta ci permette di seguire il destino delle cellule in vivo embrioni di zebrafish. Noi usiamo gli embrioni che esprimono un punto di riferimento vivo genetica (GFP) per individuare con precisione obiettivi e le cellule di interesse. Questa procedura può essere utilizzata allo stesso modo per un preciso attivazione luce indotta di proteine, ormoni, molecole di piccole dimensioni e altri composti in gabbia.
Protocol
Discussion
Photo-attivabili composti sono molecole la cui funzione è mascherato fino a quando non sono illuminati con una specifica lunghezza d'onda (di solito UV), inducendo una reazione fotochimica che converte le molecole in uno stato chimicamente o biologicamente attive. Queste sonde forniscono strumenti molto potenti per la ricerca di biologia delle cellule, poiché l'attivazione può essere controllato con precisione temporalmente e spazialmente, limitando la loro esposizione alla luce.
…
Acknowledgements
Grazie sono dovuti a Genia Brodsky per la figura grafica; Vyacheslav Kalchenko, Douglas Lutz, e Leonid Roitman per la consulenza tecnica e assistenza con i due fotoni uncaging; Maayan tahor e Suliman Elsadin di assistenza tecnica; Uwe Strahle per la gentile fornitura della linea neurogenin1 reporter e Amos Gutnick dei commenti a questo manoscritto. La ricerca in laboratorio Levkowitz è supportato dal tedesco-israeliano Foundation (codice di autorizzazione 183/2007); Israel Science Foundation (codice di autorizzazione 928/08) e la Harriet & Marcel Dekker Foundation. GL è un operatore della Cattedra Career Development Tauro nella ricerca biomedica.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Dextran-conjugated 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl (DMNB) caged fluorescein (10,000 MW dextran, anionic) | Invitrogen | D-3310 | molecular probes | |
| Agarose for injection trough and coated plates | Sigma | A9539 | ||
| Thin Wall Glass Capillaries with filament | World Precision Instruments | TW100F-6 | ||
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | ||
| Microloader tip | Eppendorf | 5242 956.003 | ||
| Pneumatic picopump | World Precision Instruments | PV820 | ||
| Phenylthiourea (PTU) | Sigma | 22290-9 | ||
| Low melting point agarose for embryo mounting | Ultra Pure LMP agarose | 16520100 | ||
| Anti-Fluorescein- alkaline phosphatase (AP) Fab fragments | Roche | 11426338910 | ||
| Fast Red | Roche | 11496549001 |
References
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Brachydanio rerio. , (1995).
- Russek-Blum, N., Nabel-Rosen, H., Levkowitz, G. High resolution fate map of the zebrafish diencephalon. Dev Dyn. 238, 1827-1835 (2009).
- Russek-Blum, N. Dopaminergic neuronal cluster size is determined during early forebrain patterning. Development. 135, 3401-3413 (2008).
- Kozlowski, D. J., Murakami, T., Ho, R. K., Weinberg, E. S. Regional cell movement and tissue patterning in the zebrafish embryo revealed by fate mapping with caged fluorescein. Biochem Cell Biol. 75, 551-562 (1997).
- Staudt, N., Houart, C. The Prethalamus Is Established during Gastrulation and Influences Diencephalic Regionalization. PLoS Biol. 5, e69-e69 (2007).
- Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 12651-12656 (2002).
- Hatta, K., Tsujii, H., Omura, T. Cell tracking using a photoconvertible fluorescent protein. Nat Protoc. 1, 960-967 (2006).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).
- Bulina, M. E. Chromophore-assisted light inactivation (CALI) using the phototoxic fluorescent protein KillerRed. Nat Protoc. 1, 947-9453 (2006).
- Adams, S. R., Tsien, R. Y. Controlling cell chemistry with caged compounds. Annu Rev Physiol. 55, 755-784 (1993).
- Wieboldt, R. Photolabile precursors of glutamate: synthesis, photochemical properties, and activation of glutamate receptors on a microsecond time scale. Proc Natl Acad Sci U S A. 91, 8752-8756 (1994).
- Marque, J. J. Using caged neurotransmitters. Nature. 337, 583-584 (1989).
- Zucker, R. Photorelease techniques for raising or lowering intracellular Ca2. Methods Cell Biol. 40, 31-63 (1994).
- Neveu, P. A caged retinoic acid for one- and two-photon excitation in zebrafish embryos. Angew Chem Int Ed Engl. 47, 3744-3746 (2008).
- Shestopalov, I. A., Sinha, S., Chen, J. K. Light-controlled gene silencing in zebrafish embryos. Nat Chem Biol. 3, 650-651 (2007).
- Ando, H., Furuta, T., Tsien, R. Y., Okamoto, H. Photo-mediated gene activation using caged RNA/DNA in zebrafish embryos. Nat Genet. 28, 317-325 (2001).
