Два-Фотон основе Фотоактивация в Живом данио рерио Эмбрионы
Summary
Многофотонная микроскопия позволяет управлять фотонами малых энергий с глубоким проникновением оптических и снижения фототоксичности. Мы описываем использование этой технологии для живых маркировки ячейку в данио эмбрионов. Этот протокол можно легко адаптировать для фото-индукции различных световых проблематику молекул.
Abstract
Фотоактивация целевых соединений в живом организме оказалось ценным подход к исследованию различных биологических процессов, таких как эмбрионального развития, клеточной сигнализации и взрослых физиологии. В этом отношении использование многофотонной микроскопии позволяет количественные фотоактивации данной свет реагировать агент в глубоких тканей в одной резолюции клетки. Как эмбрионов данио оптически прозрачны, их развитие можно наблюдать в естественных условиях. Эти черты делают данио совершенный организм модели для управления деятельностью различных химических веществ и белков сфокусированный свет. Здесь мы опишем использование двух-фотонной микроскопии, чтобы побудить активации химически клетке флуоресцеина, который, в свою очередь, позволяет проследить судьбу клетки в живых эмбрионов данио. Мы используем эмбрионов выражения жить генетических ориентир (GFP), чтобы найти и точно ориентировать любой клетки интерес. Эта процедура может быть так же использован для точного света индуцированной активации белков, гормонов, малых молекул и других клетках соединений.
Protocol
Discussion
Фото-активируемые соединения молекул, функция которого состоит в маске, пока они не освещены с определенной длиной волны (как правило, УФ), вызывающие фотохимические реакции, которая преобразует молекулы в биологически или химически активном состоянии. Эти зонды обеспечивают очень мо?…
Acknowledgements
Выражаем благодарность Женя Бродского для фигурного графика; Вячеслав Кальченко, Дуглас Лутц, и Леонид Ройтман о технической консультации и помощь в двухфотонного uncaging; Мааян тахор и Сулиман Elsadin в технической помощи; Уве Strahle за любезно предоставленные neurogenin1 линии репортер и Амос Гутник комментариев к этой рукописи. Исследования в лаборатории Levkowitz поддерживается германо-израильского фонда (грант № 183/2007); Израиль научного фонда (грант № 928/08) и Харриет и Марсель Деккер Foundation. GL является Сотрудник развития Тауро Карьера кафедрой биомедицинских исследований.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Dextran-conjugated 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl (DMNB) caged fluorescein (10,000 MW dextran, anionic) | Invitrogen | D-3310 | molecular probes | |
| Agarose for injection trough and coated plates | Sigma | A9539 | ||
| Thin Wall Glass Capillaries with filament | World Precision Instruments | TW100F-6 | ||
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | ||
| Microloader tip | Eppendorf | 5242 956.003 | ||
| Pneumatic picopump | World Precision Instruments | PV820 | ||
| Phenylthiourea (PTU) | Sigma | 22290-9 | ||
| Low melting point agarose for embryo mounting | Ultra Pure LMP agarose | 16520100 | ||
| Anti-Fluorescein- alkaline phosphatase (AP) Fab fragments | Roche | 11426338910 | ||
| Fast Red | Roche | 11496549001 |
References
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Brachydanio rerio. , (1995).
- Russek-Blum, N., Nabel-Rosen, H., Levkowitz, G. High resolution fate map of the zebrafish diencephalon. Dev Dyn. 238, 1827-1835 (2009).
- Russek-Blum, N. Dopaminergic neuronal cluster size is determined during early forebrain patterning. Development. 135, 3401-3413 (2008).
- Kozlowski, D. J., Murakami, T., Ho, R. K., Weinberg, E. S. Regional cell movement and tissue patterning in the zebrafish embryo revealed by fate mapping with caged fluorescein. Biochem Cell Biol. 75, 551-562 (1997).
- Staudt, N., Houart, C. The Prethalamus Is Established during Gastrulation and Influences Diencephalic Regionalization. PLoS Biol. 5, e69-e69 (2007).
- Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 12651-12656 (2002).
- Hatta, K., Tsujii, H., Omura, T. Cell tracking using a photoconvertible fluorescent protein. Nat Protoc. 1, 960-967 (2006).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).
- Bulina, M. E. Chromophore-assisted light inactivation (CALI) using the phototoxic fluorescent protein KillerRed. Nat Protoc. 1, 947-9453 (2006).
- Adams, S. R., Tsien, R. Y. Controlling cell chemistry with caged compounds. Annu Rev Physiol. 55, 755-784 (1993).
- Wieboldt, R. Photolabile precursors of glutamate: synthesis, photochemical properties, and activation of glutamate receptors on a microsecond time scale. Proc Natl Acad Sci U S A. 91, 8752-8756 (1994).
- Marque, J. J. Using caged neurotransmitters. Nature. 337, 583-584 (1989).
- Zucker, R. Photorelease techniques for raising or lowering intracellular Ca2. Methods Cell Biol. 40, 31-63 (1994).
- Neveu, P. A caged retinoic acid for one- and two-photon excitation in zebrafish embryos. Angew Chem Int Ed Engl. 47, 3744-3746 (2008).
- Shestopalov, I. A., Sinha, S., Chen, J. K. Light-controlled gene silencing in zebrafish embryos. Nat Chem Biol. 3, 650-651 (2007).
- Ando, H., Furuta, T., Tsien, R. Y., Okamoto, H. Photo-mediated gene activation using caged RNA/DNA in zebrafish embryos. Nat Genet. 28, 317-325 (2001).
