Investigando Tecido e órgãos específicos Responses Fitocromo usando FACS assistida Célula tipo Profiling expressão específica no Arabidopsis thaliana</em
Summary
A base molecular do espaço-respostas específicas fitocromo está sendo investigado o uso de plantas transgênicas que apresentam tecidos e órgãos específicos deficiências fitocromo. O isolamento de células específicas exibindo esgotamento cromóforo fitocromo induzida por fluorescência-Activated Celular classificação seguido por análises de microarray está sendo utilizada para identificar genes envolvidos em respostas espaciais específicos fitocromo.
Abstract
Media luz uma série de processos de desenvolvimento e de adaptação ao longo do ciclo de vida de uma planta. Plantas utilizam a luz de absorção de moléculas chamadas fotorreceptores de sentir e adaptar-se a luz. O vermelho / vermelho-extremo de absorção de luz fotorreceptores fitocromo têm sido estudadas extensivamente. Fitocromos existir como uma família de proteínas com funções distintas e sobrepostas em todos os sistemas de plantas superiores em que foram estudados<sup> 1</sup>. Respostas mediadas por fitocromo luz, que vão desde a germinação de sementes através de floração e senescência, muitas vezes são localizadas em tecidos de plantas específicas ou órgãos<sup> 2</sup>. Apesar da descoberta e elucidação das funções individuais e redundantes fitocromo através de análises de mutação, os relatórios conclusivos sobre locais distintos de photoperception e os mecanismos moleculares de piscinas localizadas de fitocromos que medeiam espacial respostas específicas fitocromo são limitadas. Nós projetamos experimentos baseados em hipóteses que os sites específicos de photoperception fitocromo regular tecido e órgão os aspectos específicos da photomorphogenesis, e que piscinas localizadas fitocromo envolver subconjuntos distintos de genes-alvo a jusante na célula a célula de sinalização. Nós desenvolvemos uma abordagem bioquímica para seletivamente reduzir fitocromos funcional em um órgão ou tecido-específicas maneira dentro de plantas transgênicas. Nossos estudos são baseados em uma abordagem enhancer trap-bipartite que resulta em transativação da expressão de um gene sob o controle da ativação elemento Seqüência Upstream (UAS) do ativador transcricional GAL4<sup> 3</sup>. A biliverdina redutase (<em> BVR</em>) Gene sob o controle da UAS é mantido em silêncio, na ausência de transativação GAL4 no pai UAS-BVR<sup> 4</sup>. Cruzamentos genéticos entre uma linhagem transgênica UAS-BVR e um GAL4-GFP enhancer resultado linha de armadilha em expressão específica do<em> BVR</em> Gene nas células marcadas pela<em> GFP</em> Expressão<sup> 4</sup>. BVR acumulação em plantas de Arabidopsis resultados na deficiência cromóforo fitocromo<em> Em planta</em<sup> 07/05</sup>. Assim, plantas transgênicas que temos produzido ativação exibem GAL4-dependente da<em> BVR</em> Gene, resultando na inativação bioquímicos do fitocromo, bem como GAL4-dependente<em> GFP</em> Expressão. Fotobiológicos molecular e análises genéticas de<em> BVR</em> Linhas de transgênicos estão rendendo introspecção em tecido e órgão-específicas mediadas por fitocromo respostas que têm sido associados a sites correspondentes de photoperception<sup> 4, 7, 8</sup>. Separação de células de fluorescência Ativado (FACS) da GFP-positivo, enhancer-armadilha induzida<em> BVR</emProtoplastos> expressando planta juntamente com células de tipo específico de perfil de expressão gênica através da análise de microarray está sendo usado para identificar supostos genes alvo downstream envolvidos na mediação espacial respostas específicas fitocromo. Esta pesquisa está se expandindo a nossa compreensão dos sítios de percepção de luz, os mecanismos através dos quais vários tecidos ou órgãos cooperam entre si à luz regulado o crescimento das plantas e desenvolvimento, e promover a dissecção molecular do fitocromo mediada por complexo celular-para-celular cascatas de sinalização.
Protocol
Discussion
Perfil de expressão gênica através de microarrays (1) indicou que mais de 30% dos genes em Arabidopsis mudas são leves regulamentados e 11 (2) identificou um vasto conjunto de genes que codificam proteínas de transdução de sinal de luz envolvidos na cascata de sinalização fitocromo 12, 13 . Tais experimentos sugerem que a luz induz a mudanças rápidas e de longo prazo na expressão genética. Cada pool de fitocromos pode controlar apenas um subconjunto de respostas de desenvolvimento e de…
Acknowledgements
Trabalho no laboratório Montgomery nas respostas fitocromo em plantas é apoiado pela National Science Foundation (Grant no. MCB-0919100 para BLM) e Ciências Químicas, Geociências e Biociências Divisão do Escritório de ciências básicas da energia, o Office of Science, EUA Departamento de energia (não concedem. FG02 DE 91ER20021 a BLM). Agradecemos a Melissa Whitaker de assistência técnica durante as filmagens e leitura crítica do manuscrito, Stephanie Costigan de assistência experimental, Dr. Luís Rei de assistência ao desenvolvimento e otimização de fluorescência-Activated Celular classificação protocolos para a classificação de protoplastos Arabidopsis e Frame Dr. Melinda para assistência com confocal microscopia. Agradecemos a Marlene Cameron para a assistência de design gráfico e Bird Karen de assistência editorial.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Anti-BVR antibody | QED Bioscience Inc. | 56257-100 | ||
| Cellulase “Onozuka” R-10 | SERVA Electrophoresis GmbH, Crescent Chemical Company | MSPC 0930 | ||
| Gamborg’s B5 basal salt mixture | Sigma | G5768 | ||
| Macerozyme R-10 | SERVA Electrophoresis GmbH, Crescent Chemical Company | PTC 001 | ||
| MES, low moisture content | Sigma | M3671 | ||
| Murashige and Skoog salts | Caisson Laboratories | 74904 | ||
| Phytablend | Caisson Laboratories | 28302 | ||
| RNeasy Plant Minikit | Qiagen | 16419 |
References
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