Undersöka Tissue-och orgel-specifika Phytochrome Svar med FACS-assisterad Cell-typspecifika expression profiling i Arabidopsis thaliana</em
Summary
Den molekylära grunden för rumslig-specifika phytochrome svar utreds med hjälp av transgena växter som uppvisar vävnader och organ-specifika phytochrome brister. Isolering av specifika celler uppvisar inducerad phytochrome kromofor utarmning av Fluorescens-Aktivt cellsortering följt av microarray-metoder håller på att utnyttjas för att identifiera gener som är involverade i fysisk-specifika phytochrome svar.
Abstract
Ljus förmedlar en rad utvecklings-och adaptiva processer i hela livscykeln för en växt. Växter använder ljusabsorberande molekyler som kallas fotoreceptorer att känna av och anpassa sig till ljuset. Den röda / långt rött ljusabsorberande phytochrome fotoreceptorer har studerats ingående. Phytochromes existera som en familj av proteiner med olika och överlappande funktioner i alla högre växt system där de har studerat<sup> 1</sup>. Phytochrome-medierad ljus svar, som sträcker sig från frögroning genom blomning och åldrande, är ofta lokaliserade till en specifik anläggning vävnader eller organ<sup> 2</sup>. Trots upptäckten och belysning av enskilda och redundant phytochrome funktioner genom mutationsstatus analyser, entydiga rapporter om olika platser i photoperception och de molekylära mekanismerna av lokaliserad pooler av phytochromes som förmedlar rumsliga-specifika phytochrome svar är begränsade. Vi designade experiment bygger på hypoteser som specifika platser för phytochrome photoperception reglerar vävnader och organ-specifika aspekter av photomorphogenesis, utan att lokala phytochrome pooler engagera olika grupper av nedströms mål gener i cell-till-cell signalering. Vi utvecklade en biokemisk metod för att selektivt minska funktionella phytochromes i ett organ eller vävnad-specifika sätt inom transgena växter. Våra studier är baserade på en tvåparts förstärkare-fällan strategi som resulterar i transactivation av uttrycket av en gen under kontroll av Upstream Aktivering Sequence (UAS) inslag av transkriptionell aktivator GAL4<sup> 3</sup>. Den biliverdin reduktas (<em> BVR</em>) Genen under kontroll av yrkeshögskolan är tyst kvar i avsaknad av GAL4 transactivation i UAS-BVR förälder<sup> 4</sup>. Genetisk korsningar mellan en UAS-BVR transgen linje och en GAL4-GFP förstärkare trap line resultera i särskilt uttryck för den<em> BVR</em> Genen i rutor markerade med<em> GFP</em> Uttryck<sup> 4</sup>. BVR ackumulering i Arabidopsis växter som resulterar i phytochrome kromofora brist<em> I Planta</em<sup> 5-7</sup>. Således transgena växter som vi har producerat utställningen GAL4-beroende aktivering av<em> BVR</em>-Genen, vilket resulterar i de biokemiska inaktivering av phytochrome samt GAL4-beroende<em> GFP</em> Uttryck. Fotobiologisk och molekylärgenetiska analyser av<em> BVR</em> Transgena linjer ger en inblick i vävnader och organ-specifika phytochrome-medierad reaktioner som har förknippats med motsvarande webbplatser hos photoperception<sup> 4, 7, 8</sup>. Fluorescens Aktiverat cellsortering (FACS) av GFP-positiva, enhancer-trap-inducerad<em> BVR</em>-Uttryck anläggning protoplasts tillsammans med cell-typspecifika profilering av genuttryck via microarray analys används för att identifiera förmodade nedströms mål gener inblandat i spatial-specifika phytochrome svar. Denna forskning ökar vår förståelse av platser av ljus perception, de mekanismer genom vilka olika vävnader eller organ samarbetar i ljus-reglerad växternas tillväxt och utveckling, samt av den molekylära dissekering av komplexa phytochrome-medierad cell-till-cell signalering kaskader.
Protocol
Discussion
Gene expression profiling genom microarrays (1) har visat att mer än 30% av de gener i Arabidopsis plantor är lätta regleras 11 och (2) har identifierat en stor grupp av gener som kodar ljuset proteiner signaltransduktion inblandade i phytochrome signalering kaskad 12, 13 . Sådana experiment tyder på att ljus inducerar snabb och långsiktiga förändringar i genuttryck. Varje pool av phytochromes kan styra bara en delmängd av utvecklings-och adaptiva svar. Dessutom är det troligt att nedstr?…
Acknowledgements
Arbetet i Montgomery labbet på phytochrome reaktioner i växter stöds av National Science Foundation (bidrag nr. MCB-0.919.100 till BLM) och Chemical Sciences, geovetenskaper och biovetenskaper Division Office of Basic Energy Sciences, Office of Science, US Department of Energi (bidrag nr. DE FG02 91ER20021 till BLM). Vi tackar Melissa Whitaker för tekniskt stöd under inspelningen och kritiskt läsa manuskriptet, Stephanie Costigan för experimentell hjälp, Dr Louis King för hjälp med att utveckla och optimera Fluorescens-aktiverade cellsortering protokoll för Arabidopsis protoplastfusion sortering och Dr Melinda Ram för hjälp med konfokala mikroskopi. Vi tackar Marlene Cameron för grafisk design hjälp och Karen Bird för redaktionell hjälp.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Anti-BVR antibody | QED Bioscience Inc. | 56257-100 | ||
| Cellulase “Onozuka” R-10 | SERVA Electrophoresis GmbH, Crescent Chemical Company | MSPC 0930 | ||
| Gamborg’s B5 basal salt mixture | Sigma | G5768 | ||
| Macerozyme R-10 | SERVA Electrophoresis GmbH, Crescent Chemical Company | PTC 001 | ||
| MES, low moisture content | Sigma | M3671 | ||
| Murashige and Skoog salts | Caisson Laboratories | 74904 | ||
| Phytablend | Caisson Laboratories | 28302 | ||
| RNeasy Plant Minikit | Qiagen | 16419 |
References
- Franklin, K. A., Quail, P. H. Phytochrome functions in Arabidopsis development. J. Exp. Bot. 61, 11-24 (2010).
- Montgomery, B. L. Right place, right time: Spatiotemporal light regulation of plant growth and development. Plant Signal Behav. 3, 1053-1060 (2008).
- Laplaze, L. GAL4-GFP enhancer trap lines for genetic manipulation of lateral root development in Arabidopsis thaliana. J. Exp. Bot. 56, 2433-2442 (2005).
- Costigan, S., Warnasooriya, S. N., Montgomery, B. L. Root-localized phytochrome chromophore synthesis is required for tissue-specific photoregulation of root elongation and impacts sensitivity to jasmonic acid in Arabidopsis thaliana. , .
- Lagarias, D. M., Crepeau, M. W., Maines, M. D., Lagarias, J. C. Regulation of photomorphogenesis by expression of mammalian biliverdin reductase in transgenic Arabidopsis plants. Plant Cell. , 675-688 (1997).
- Montgomery, B. L., Yeh, K. C., Crepeau, M. W., Lagarias, J. C. Modification of distinct aspects of photomorphogenesis via targeted expression of mammalian biliverdin reductase in transgenic Arabidopsis plants. Plant Physiol. 121, 629-639 (1999).
- Warnasooriya, S. N., Montgomery, B. L. Detection of spatial-specific phytochrome responses using targeted expression of biliverdin reductase in Arabidopsis. Plant Physiol. 149, 424-433 (2009).
- Warnasooriya, S. N., Porter, K. J., Montgomery, B. L. Light-dependent anthocyanin accumulation and phytochromes in Arabidopsis thaliana. , .
- Denecke, J., Vitale, A. The use of protoplasts to study protein synthesis and transport by the plant endomembrane system. Methods Cell Biol. 50, 335-348 (1995).
- Birnbaum, K. Cell type-specific expression profiling in plants via cell sorting of protoplasts from fluorescent reporter lines. Nat. Methods. 2, 615-619 (2005).
- Ma, L. Light control of Arabidopsis development entails coordinated regulation of genome expression and cellular pathways. Plant Cell. 13, 2589-2607 (2001).
- Chen, M., Chory, J., Fankhauser, C. Light signal transduction in higher plants. Annu. Rev. Genet. 38, 87-117 (2004).
- Ulm, R., &, N. a. g. y., F, . Signalling and gene regulation in response to ultraviolet light. Curr. Opin. Plant Biol. 8, 477-482 (2005).
- Ma, L. Organ-specific expression of Arabidopsis genome during development. Plant Physiol. 138, 80-91 (2005).
- Neff, M. M., Fankhauser, C., &, C. h. o. r. y., J, . Light: an indicator of time and place. Genes Dev. 14, 257-271 (2000).
- Birnbaum, K. A gene expression map of the Arabidopsis root. Science. 302, 1956-1960 (2003).
