Voorbereiden weefsels worden bekeken op de dia's Een colonoscoop kunnen worden doorgegeven in de dikke darm via het rectum. Een colonoscoop is een lange buis die verlichting en een video camera op het hoofd heeft, de mogelijkheid geven lucht in de dikke darm op te blazen als een lange ballon tot een betere visualisatie van de dikke darm toe te staan, en heeft een doorgang voor biopsie tang die kunnen verder reiken dan de video-camera knijpen een 3-5 millimeter ruimte van de binnenkant "huid" of mucosale laag van de dikke darm om ons een biopt. De biopsie tang kan ook gebruikt worden om mogelijk te verwijderen pre-kanker poliepen in de dikke darm. We biopten van de normale dikke slijmvliezen weefsel van patiënten, met een informed consent. Deze patiënten ondergingen een screening coloscopie in een gastro-intestinale kliniek. Onze biopten werden geplaatst in potten van formaline. Na 4 uur werd de formaline vervangen door 70% alcohol. Soortgelijke monsters van weefsel werden genomen uit gebieden van de dikke darm resecties, verwijderd tijdens de operatie, die een cm en 10 cm uit de buurt van dikke darm kanker of adenomen met geavanceerde neoplasie. Deze weefselmonsters werden ook geplaatst in formaline, en als het weefsel monsters werden groot, sommigen werden gehouden in formaline voor een langere periode voordat ze geplaatst in 70% alcohol. Het weefsel monsters worden genomen om een laboratorium voor histologie worden verwerkt en geplaatst in paraffine blokken. Paraffine blokken worden gekoeld in de koelkast zodat ze gemakkelijker gesneden door een microtoom. Weefselcoupes van 4 micron dikte worden gesneden uit het weefsel blokken, met behulp van een microtoom, en dreef op het water. Voor het vergelijken van expressie van twee eiwitten, bijvoorbeeld ERCC1 en PMS2, kunnen alternatieve weefselcoupes worden opgehaald op twee glijbanen, tot er drie weefselcoupes op elk van de twee dia's. Zo kan de delen 1, 3 en 5 worden geplaatst op een dia label ERCC1 en de hoofdstukken 2, 4 en 6 kan worden geplaatst op een dia label PMS2. Met drie weefselcoupes immunostained voor een eiwit op een enkele dia kan u toestaan om te zien of een ongewoon kleuringspatroon van een crypte is een artefact is of echt, want artefacten zou niet worden herhaald in meer dan een weefselsectie op een dia. Colon crypten zijn ongeveer 60 micrometer in diameter, zodat ongeveer 15 weefselcoupes kunnen worden verlaagd door middel van een crypte, en dezelfde crypte zou kunnen worden bekeken op meerdere weefselcoupes per slide. Immunokleuring weefselcoupes De dia's worden vervolgens door middel van de immunohistochemische etikettering procedure. Dit is een 8 uur procedure, en is vrij standaard. De onderdelen van de procedure die we gebruiken, die niet standaard zijn, zijn het gebruik van Sequenza containers voor vlekken, en het gebruik van een oplossing voor achtergrondkleuring genaamd "Sniper" te verminderen. De 'Sniper' oplossing is verkocht als een gepatenteerde formule door Biocare Medical, Concord CA. Sommige van de stappen van onze procedures worden hier getoond. Als een voorbeeld, voor PMS2 immunohistochemie, dia's worden eerst ontdaan door het plaatsen van in 3 veranderingen van xyleen (3 minuten elk), gevolgd door twee veranderingen in 100% ethanol (2 minuten elk), gevolgd door twee veranderingen in 95% ethanol (2 minuten elk), gevolgd door twee wijzigingen in gedestilleerd water (2 minuten). Deze procedures worden uitgevoerd onder een chemische kap met een negatieve luchtdruk, zodat de onderzoeker niet wordt blootgesteld aan de dampen. Toen formaline werd aanvankelijk gebruikt om het weefsel te repareren, onderdelen van de eiwitten in het weefsel monster werd cross-linked. Nu moeten we de cross-links te breken, zodat een antilichaam kan het eiwit van belang te erkennen. De dia's worden geplaatst in een buffer oplossing die aan de kook gebracht in een magnetron. Dit wordt gevolgd door 10 minuten op de medium setting, gevolgd door afkoeling gedurende 20 minuten op ijs. Deze stap moet worden getest en aangepast voor verschillende magnetrons, tot goede resultaten worden bereikt. Merk op dat voor immunokleuring CcOI of Ku86 we een natriumcitraatbuffer gemaakt met 9ml citroenzuur + 41mL natriumcitraat + 450 ml H 2 O (een buffer met natrium-ionen) die een pH van ongeveer 6,0 had, voor ERCC1 hebben we gebruik gemaakt van een gemaakt citraatbuffer gebruikt met 2,1 g citroenzuur + 1 liter H 2 O + ~ 5 ml natriumhydroxide om de pH te brengen naar 6,1 (een buffer met een minimum aan toegevoegde natrium-ionen), en voor PMS2 gebruikten we een oplossing gemaakt met 5 ml Antigen ontmaskeren oplossing (door VECTOR) + 533mL H 2 O. Verschillende buffers zijn nodig om antilichamen interactie te verhogen met bepaalde proteïne epitopen. De dia's worden vervolgens in 3% waterstofperoxide (verdund in methanol) gedurende 20 minuten, gevolgd door een in gedestilleerd water spoelen gedurende 3 minuten, en gewassen in fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS genoemd) voor 5 minuten. Dia's worden vervolgens geplaatst in platte smalle vlekken racks genaamd Sequenza (Shandon Sequenza Immunokleuring System van Thermo Scientific) en gespoeld met PBS. De slides die immunostained voor ERCC1 of PMS2 worden dan blootgesteld aan 10 minnuten blootstelling aan een extra behandeling van drie druppels van een eigen oplossing, verkregen uit Biocare, genaamd 'Sniper', die optreedt te verminderen niet-specifieke kleuring van eiwitten achtergrond. De dia's worden gespoeld met een buffer "TBST" dat is 1 ml Tween + 100 ml Tris 10x + 900 ml gedestilleerd water [waar 10x Tris is 24,2 gram Trizma + 80 gram NaCl + 1000 ml gedestilleerd en gedemineraliseerd water + geconcentreerd HCl (ongeveer 15 ml) om de oplossing tot pH 7,6] te brengen. Dia's worden vervolgens gespoeld drie keer met buffer, en 100 microliter DAKO gebiotinyleerd secundair antilichaam bij 1:100 verdunning (in 2% boviene serumalbumine gemaakt in buffer TBST) wordt toegevoegd aan de dia's en geïncubeerd gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Op dit punt is Vectastain ABC (avidine Biotine Complex) (van Vector Laboratories) reagens bereid met behulp van 2,5 ml PBS, 1 druppel oplossing A, 1 druppel oplossing B, en de oplossing is toegestaan om 30 minuten staan. De dia's worden gespoeld drie keer met TBST buffer. Dan 3 druppels Vectastain ABC reagens wordt toegevoegd en de dia's worden geïncubeerd bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten, gevolgd door spoelen 2 keer met TBST. Dia's worden vervolgens ondergedompeld in DAB (diamino-benzamide) (2,9 ml DAB + 400 microliter PBS + 250 microliter waterstofperoxide) voor ongeveer 5 minuten. Dia's worden vervolgens gespoeld twee maal met gedestilleerd, gedemineraliseerd water. Tegenkleuring wordt gedaan met een verdunde oplossing van hematoxyline gedurende 10 seconden. Dia's worden grondig gespoeld met kraanwater en vervolgens met gedemineraliseerd water. Dia's worden vervolgens gedehydrateerd 2 keer voor 2 minuten in 95% ethanol, twee keer voor 2 minuten in 100% ethanol en 2 keer voor 2 minuten in xyleen. Een paar druppels Cytoseal XYL (Richard-Allan Scientific) worden vervolgens toegevoegd aan de dia's en een dekglaasje toegepast. Immunohistochemische evaluatie van ERCC1, Ku86 en CcOI worden uitgevoerd met hetzelfde protocol als voor PMS2, maar het vervangen van de PMS2 antilichaam met antilichamen voor ERCC1, Ku86 en CcOI beschreven in de onderstaande tabel. Het evalueren van weefsel secties voor crypten deficiënt in de expressie van ERCC1, PMS2, Ku86 en CcOI We zullen eerst kijken naar weefselcoupes onder een Motic (DM-BA300) photomicroscope voor expressie van PMS2 en ERCC1 in crypten van het colon mucosa. PMS2 en ERCC1 zijn beide DNA-herstel enzymen, en dus zijn ze gevestigd waar het DNA is, in de kernen van cellen van de crypten. Dit wordt aangegeven in figuur 1, waar de bruine dikke darm die kleuring voor ERCC1, komt in de kernen van cellen in een crypte. De normale crypte we eerst laten zien in de microscoop werd gekleurd ERCC1, en de bruine vlek toont de locatie van ERCC1. We wijzen op de aard van de cellen in de crypten, waar "beker cellen" hebben de vorm van een beetje zoals een wijnglas, met kernen in een klein gebied aan de voet van de cellen op de buitenste rand van de crypte en een ballonvaart uit sectie, gevuld met witte mucine korrels in het deel van de cel aan de binnenkant van de crypte. De andere twee soorten cellen zien er een beetje gelijk in onze gekleurde coupes, en ze zijn de enterocyten en enteroendocrine cellen en hun kernen zijn ook aan de buitenste rand van de crypte, aan de voet van de cellen. In biopten afgenomen bij patiënten die nog nooit een colon neoplasie, of in biopten ver van een site van dikke darm kanker, bijna alle van de kernen in alle crypten vertonen een normale hoog niveau van expressie van ERCC1 zoals hier te zien. Te oriënteren onze waarnemingen, weefsel verkregen van biopten van patiënten zonder colon neoplasie worden waargenomen voor de niveaus van expressie van PMS2, ERCC1, CcOI of Ku86 in normale colon mucosa. We kunnen observeren alle crypten in een normaal weefsel sectie, met een 40x objectief, terwijl we langzaam gaan een hele weefsel sectie en wijzen op de crypten, de interstitiële cellen, lymfoïde eventuele knobbeltjes op de dia en de muscularis (indien aanwezig in het biopt). We wijzen er ook op dat er slechts enkele cellen aan de basis van de crypte die de stamcellen. Deze stamcellen genereren van alle van de ongeveer 2000 cellen van de volledige crypte. Een stamcel met een mutatie of een epimutation kan nemen over het hele stamcel niche. Dan is de hele crypte kan hebben veranderd aankleuring voor een enzym van belang (crypt conversie) als we laten zien in deze nieuwe glijbaan waar we hele crypten deficiënt zijn voor CcOI naast crypten dat hoge expressie van CcOI hebben. Dan laten we zien een dia van een patiënt met een darmkanker of een adenoom met geavanceerde neoplasie. Op deze dia, een aantal crypten een normale hoog niveau van expressie van ERCC1 en sommige hebben een lagere niveaus van expressie. Alle crypten in het weefsel sectie zijn gefotografeerd bij een lage resolutie met een 10x objectief, en de beelden zijn betegeld, zodat het hele weefsel sectie is te zien in een beeld. De crypten zijn dan genummerd. De crypten met een hoge expressie van het enzym, typisch van de crypten in biopten veel from welke vorm van kanker, worden genoemd niveau "4" vlekken. Andere niveaus zijn "0" als er geen waarneembare uitdrukking, "1" als gewoon nauwelijks detecteerbaar expressie is duidelijk, "2" als er sprake is expressie aanwezig, maar op een veel lager niveau dan niveau 4, en "3" als uitdrukking aanwezig zijn op een lager niveau dan vier, maar vrij sterk. We dot elke dia op de lage resolutie afbeelding blauw voor 4, groen voor 3, geel voor 2, oranje voor een en rood voor 0. Hier laten we gaan door een sectie van een biopsie met behulp van een 40x objectief lens. We puntjes op de crypten op de lage resolutie afbeelding. Figuur 1. Een dikke crypte met hoge expressie van ERCC1 in de kernen van de crypte cellen. Alle kleuren in dit beeld waren even verbeterd contrast en verzadiging, met behulp van Paint Shop Pro 5. Representatieve resultaten De alternatieve weefselcoupes op afzonderlijke dia's stellen ons in staat om te kijken naar hetzelfde colon crypten, met expressie van twee verschillende eiwitten aangetoond door immunohistochemie. Het beeld van een crypte gekleurd voor PMS2 en dezelfde crypte gekleurd voor ERCC1 wordt getoond op de aangrenzende microscopen met aangrenzende computer monitors. Dit laat ons toe om te bepalen of er gezamenlijk tekort voor twee eiwitten of dat de tekortkomingen in elk van de eiwitten, terwijl elke is frequent, onafhankelijk optreedt. We hebben drie weefsel per dia, zodat een duidelijk tekort in de expressie van een eiwit kan worden geverifieerd als zijnde gebrekkig op meer dan een sectie, en niet te wijten aan een artefact. In de weefsels rond colon kanker, waar sprake is van een defect veld die aanleiding geven tot de kanker, is er een hoge frequentie van crypten deficiënt zijn voor ERCC1 en PMS2. We hebben ook gebruik gemaakt immunohistochemie om de frequentie van crypten deficiënt te vinden voor Ku86 en CcOI. Op deze dia, gaan we een hele weefselsectie immunostained voor Ku86, met behulp van een 40x objectief, en we kunnen zien dat er weinig crypten deficiënt zijn voor Ku86 in dit weefsel sectie. Ook op deze dia, gaan we een hele weefselsectie immunostained voor CcOI, met behulp van een 40x objectief, en we kunnen zien dat slechts een matig aantal crypten deficiënt zijn voor CcOI.