Vorbereitung Gewebe auf Folien angezeigt werden Ein Koloskop kann in den Dickdarm durch den Mastdarm weitergegeben werden. Ein Koloskop ist ein langer Schlauch, der Beleuchtung und eine Videokamera an der Spitze hat, die Fähigkeit, Luft in den Darm passieren, um es zu sprengen, wie ein langer Ballon zur besseren Visualisierung des Dickdarms zu ermöglichen, und hat einen Durchgang für Biopsiezangen, dass kann erstrecken sich über die Videokamera zu kneifen Sie einen 3-5 Millimeter Bereich der inneren Oberfläche "Haut" oder Schleimschicht des Darms, um uns eine Biopsie. Die Biopsiezange kann auch verwendet werden, um potenziell entfernen präkanzeröse Polypen im Dickdarm gefunden werden. Wir erhalten Biopsien von normalen Kolon-Schleimhaut-Gewebe von Patienten mit der Einwilligung. Diese Patienten befanden sich einer Vorsorge-Koloskopie in einem Magen-Darm-Klinik. Unsere Biopsien wurden in Gläsern von Formalin gelegt. Nach 4 Stunden wurde das Formalin durch 70% Alkohol ersetzt. Ähnliche Gewebeproben wurden aus dem Bereich der Doppelpunkt Resektion, bei der Operation entfernt werden, dass 1 cm und 10 cm entfernt von Darmkrebs oder Adenome mit fortgeschrittenen Neoplasien wurden. Diese Gewebeproben wurden auch in Formalin gelegt, und wenn die Gewebeproben waren groß, einige wurden in Formalin für einen längeren Zeitraum, bevor sie in 70% Alkohol gelegt gehalten. Die Gewebeproben werden einem histologischen Labor für bearbeitet und in Paraffin-Blöcke übernommen. Paraffin-Blöcke sind in einem Kühlschrank, damit sie leichter durch ein Mikrotom geschnitten gekühlt. Gewebeschnitte von 4 Mikrometer Dicke aus dem Gewebe Blöcke geschnitten, mit einem Mikrotom, und schwebte auf dem Wasser. Für den Vergleich Expression von zwei Proteinen, zum Beispiel ERCC1 und PMS2 können alternative Gewebeschnitte bis auf zwei Schlitten abgeholt werden, bis es drei Gewebeschnitte auf jedem der beiden Folien sind. Zum Beispiel können Abschnitte 1, 3 und 5 auf einer Folie beschriftet ERCC1 und den Abschnitten 2, 4 und 6 auf einer Folie beschriftet PMS2 platziert werden können platziert werden. Mit drei Gewebeschnitte immungefärbt für ein Protein auf einer einzelnen Folie ermöglichen es Ihnen, zu sehen, ob eine ungewöhnliche Färbung Muster einer Krypta ist ein Artefakt oder real ist, da Artefakte nicht in mehr als einem Gewebeschnitt auf einer Folie wiederholt werden. Colon Krypten sind etwa 60 Mikrometer im Durchmesser, so dass etwa 15 Gewebeschnitte durch eine Krypta konnte reduziert werden, die gleiche Krypta konnte auf mehreren Gewebeschnitte pro Folie angezeigt werden. Immunfärbung Gewebeschnitten Die Folien werden dann durch die immunhistochemische Markierung Verfahren gestellt. Dies ist ein 8 Stunden Prozedur, und ist ziemlich Standard. Die Teile des Verfahrens, die wir verwenden, die nicht Standard, Verwendung von Sequenza Container für die Färbung, und die Verwendung einer Lösung, um die Hintergrundfärbung genannten "Sniper" zu reduzieren. Die "Sniper"-Lösung ist als proprietäre Formel Biocare Medical, Concord CA verkauft. Einige der Schritte von unserem Verfahren werden hier gezeigt. Als Beispiel für PMS2 Immunhistochemie, Folien ersten deparaffinierten indem in 3 Änderungen von Xylol (3 Minuten), gefolgt von 2 Änderungen in 100% Ethanol (2 Minuten), gefolgt von 2 Änderungen in 95% Ethanol (2 Minuten, gefolgt jedes), gefolgt von 2 Änderungen von destilliertem Wasser (2 Minuten). Diese Verfahren werden im Rahmen eines chemischen Kapuze mit Unterdruck durchgeführt, so dass der Experimentator nicht den Dämpfen ausgesetzt. Wenn Formalin wurde ursprünglich verwendet, um das Gewebe zu beheben, wurden Teile der Proteine in der Gewebeprobe vernetzt. Jetzt müssen wir die Querverbindungen zu brechen, so dass ein Antikörper das Protein von Interesse erkennen kann. Die Folien sind in einer Pufferlösung, die zum Kochen in der Mikrowelle gebracht wird gestellt. Diese um 10 Minuten auf der mittleren Einstellung wird gefolgt durch Abkühlen für 20 Minuten auf Eis. Dieser Schritt muss geprüft und für verschiedene Mikrowellen eingestellt werden, bis gute Ergebnisse erzielt werden. Beachten Sie, dass für die Immunfärbung CCOI oder Ku86 wir eine Natriumcitratpuffer mit 9 mL Zitronensäure + 41ml Natriumcitrat + 450 ml H 2 O (ein Puffer mit Natrium-Ionen), die einen pH-Wert von etwa 6,0 hatte, für ERCC1 verwendeten wir einen Citratpuffer made verwendet mit 2,1 g Zitronensäure + 1 Liter H 2 O + ~ 5 ml Natronlauge auf pH-Wert auf 6,1 (Puffer mit geringem Zusatz von Natrium-Ionen) zu bringen, und für PMS2 verwendeten wir eine Lösung mit 5 ml Antigen Demaskierung Lösung (von VECTOR) + 533mL gemacht H 2 O. Verschiedene Puffer werden benötigt, um Antikörper-Wechselwirkung mit bestimmten Protein-Epitope zu erhöhen. Die Folien werden dann in 3% Wasserstoffperoxid (verdünnt in Methanol) für 20 Minuten durch einen in destilliertem Wasser spülen für 3 Minuten und wusch in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS genannt) für 5 Minuten setzen. Folien werden dann in flachen schmalen Färbegestelle genannt Sequenza (Shandon Sequenza Immunfärbung System von Thermo Scientific) gelegt und mit PBS gespült. Die Folien werden für ERCC1 oder PMS2 immungefärbt werden dann 10 min ausgesetztnuten Exposition einen zusätzlichen Behandlung von 3 Tropfen eine proprietäre Lösung, aus Biocare erhalten, genannt "Sniper", die auf nicht-spezifische Färbung von Proteinen zu reduzieren Hintergrund wirkt. Die Folien sind mit einem Puffer "TBST", die 1 ml Tween + 100 ml 10x Tris + 900 ml destilliertem Wasser wird [wo 10x Tris beträgt 24,2 Gramm Trizma + 80 Gramm NaCl + 1.000 ml destilliertem und entionisiertem Wasser + konzentrierter HCl (ca. 15 gespült ml), um die Lösung auf pH 7,6]. Folien werden dann dreimal mit Puffer gespült und 100 Mikroliter DAKO biotinylierten sekundären Antikörper bei 1:100 Verdünnung (in 2% Rinderserumalbumin in Puffer TBST gemacht) wird, um die Folien hinzugefügt und inkubiert für 30 Minuten bei Raumtemperatur. An dieser Stelle ist Vectastain ABC (Avidin Biotin Complex) (von Vector Laboratories) Reagenz hergestellt, mit 2,5 ml PBS, 1 Tropfen Lösung A, 1 Tropfen Lösung B, und die Lösung wird für 30 Minuten ruhen lassen. Die Folien sind 3 mal mit TBST gespült. Dann wurden 3 Tropfen Vectastain ABC-Reagenz zugesetzt und die Folien sind bei Raumtemperatur für 30 Minuten inkubiert, gefolgt von Spülen 2 mal mit TBST. Folien werden dann in DAB (Diamino-benzamid) (2,9 ml DAB + 400 Mikroliter PBS + 250 Mikroliter Wasserstoffperoxid) für ca. 5 Minuten getaucht. Folien werden dann 2 mal mit destilliertem, deionisiertem Wasser gespült. Gegenfärbung mit einer verdünnten Lösung von Hämatoxylin für 10 Sekunden. Slides sind gründlich in Leitungswasser durch VE-Wasser gespült. Folien werden dann entwässert 2 Mal für 2 Minuten in 95% Ethanol, 2-mal 2 Minuten lang in 100% Ethanol und 2-mal 2 Minuten lang in Xylol. Ein paar Tropfen Cytoseal XYL (Richard-Allan Scientific) werden dann auf die Folien hinzugefügt und ein Deckglas aufgebracht. Immunhistochemische Auswertung der ERCC1, Ku86 und CCOI werden mit dem gleichen Protokoll wie für PMS2, wobei jedoch die PMS2 Antikörper mit Antikörpern für ERCC1, Ku86 und CCOI beschrieben in der Tabelle unten. Auswertung Gewebeschnitten für Krypten Mangel an Ausdruck ERCC1, PMS2, Ku86 und CCOI Wir werden sehen Gewebes Teile zuerst unter einem Motic (DM-BA300) Photomikroskop für die Expression von PMS2 und ERCC1 in Krypten der Darmschleimhaut. PMS2 und ERCC1 sind beide DNA-Reparatur-Enzyme, und so sie sich befinden, wo die DNA ist, in den Kernen der Zellen der Krypten. Dies ist in Abbildung 1, wo die braune Doppelpunkt darstellt Färbung für ERCC1, tritt in den Kernen der Zellen in einer Krypta angegeben. Die normale Krypta zeigen wir zunächst in das Mikroskop wurde für ERCC1 gefärbt, und die braune Färbung zeigt den Standort der ERCC1. Wir weisen darauf hin, welche Arten von Zellen in den Krypten, wo "Becherzellen" so etwas wie ein Weinglas geformt sind, mit Kernen auf eine kleine Region an der Basis der Zellen am äußeren Rand der Krypta und eine Ballonfahrt aus Abschnitt gefüllt mit weißem Schleim Granulat in dem Teil der Zelle auf der Innenseite der Krypta. Die beiden anderen Arten von Zellen wirken etwas gleichermaßen in unseren gefärbten Schnitten, und sie sind die Enterozyten und enteroendokrinen Zellen und ihre Kerne sind auch an den äußeren Rand der Gruft, an der Basis der Zellen. In Biopsien von Patienten, die nie ein Kolon-Neoplasien oder in Biopsien weit entfernt von jeder Seite von Darmkrebs genommen, zeigen fast alle Kerne in allen Krypten normalen hohes Maß an Ausdruck ERCC1 wie hier gezeigt. Zur Ausrichtung unserer Beobachtungen, Gewebeschnitte aus Biopsien von Patienten mit Kolon-Neoplasien nicht erhalten werden, für die Stufen der Expression von PMS2, ERCC1, CCOI oder Ku86 in normalen Darmschleimhaut beobachtet. Wir alle können die Krypten in einem normalen Gewebe Abschnitt zu beobachten, mit einem 40x Objektiv, als wir durch eine ganze Gewebeschnitte und weisen darauf hin, die Krypten, die interstitiellen Zellen, jede lymphoide Knötchen auf der Folie, und die Muscularis langsam gehen (falls vorhanden in der Biopsie). Wir weisen auch darauf hin, dass es nur einige Zellen an der Basis der Krypta, die die Stammzellen sind. Diese Stammzellen erzeugen alle der rund 2.000 Zellen des gesamten Krypta. Eine Stammzelle mit einer Mutation oder einer Epimutationen kann über den ganzen Stammzellnische nehmen. Dann wird die ganze Krypta kann geändert Färbung für ein Enzym von Interesse (Krypta conversion), wie wir in dieser neuen Folie, wo wir ganze Krypten mangelhaft sehen für CCOI neben Krypten, die hohe Expression von CCOI haben zu zeigen. Dann zeigen wir ein Bild von einem Patienten mit einem Kolonkarzinom oder ein Adenom mit fortgeschrittenen Neoplasien. Auf dieser Folie sind einige Krypten normalen hohes Maß an Ausdruck für ERCC1 und einige haben eine niedrigere Ebenen des Ausdrucks. Alle der Krypten innerhalb des Gewebes Abschnitt sind in niedriger Auflösung mit einem 10x Objektiv fotografiert und die Bilder sind gefliest, so dass das gesamte Gewebe Abschnitt in einem Bild zu sehen ist. Die Krypten werden dann gezählt. Die Krypten mit hoher Expression des Enzyms, die typisch für Krypten in Biopsien weit herm jedem Krebs, genannt Ebene "4" Färbung. Andere Ebenen "0", wenn es keinen Ausdruck nachweisbar, "1", wenn gerade noch nachweisbare Expression ist offensichtlich, "2", wenn es Ausdruck vorhanden, aber auf einem viel niedrigeren Niveau als Stufe 4, und "3", wenn expression in einer Menge von weniger als 4, aber ziemlich stark. Wir dot jede Folie auf dem Bild mit niedriger Auflösung blau für 4, grün für 3, gelb für 2, orange für 1 und rot für 0. Hier zeigen wir durch einen Abschnitt aus einer Biopsie mit einem 40x Objektiv gehen. Wir dot die Krypten auf dem Bild mit niedriger Auflösung. Abbildung 1. A colonic Krypta zeigt eine hohe Expression von ERCC1 in den Kernen der Krypta Zellen. Alle Farben in diesem Bild waren gleichermaßen in Kontrast und Sättigung erhöht, mit Paint Shop Pro 5. Repräsentative Ergebnisse Der alternative Gewebeschnitte auf separaten Folien ermöglichen es uns, gleichzeitig Kolonkrypten Look, mit Ausdruck von zwei unterschiedlichen Proteinen durch Immunhistochemie dargestellt. Das Bild von einer Krypta gefärbt PMS2 und derselben Gruft gefärbt ERCC1 ist auf benachbarten Mikroskope mit benachbarten Computer-Monitoren gezeigt. Dies ermöglicht es uns, festzustellen, ob es gemeinsame Mangel für zwei Proteine, oder ob die Mängel in jedem der Proteine, während jeder ist häufig, tritt unabhängig. Wir haben drei Gewebeschnitte pro Folie, so dass keine offensichtlichen Mangel an Expression eines Proteins als auf mehr als einem Abschnitt mangelhaft, und nicht aufgrund eines Artefakts überprüft werden kann. In umgebenden Gewebe Darmkrebs, wo gibt es ein Feld auslösenden Fehler, den Krebs, gibt es eine hohe Frequenz von Krypten mangelhaft für ERCC1 und PMS2. Wir haben auch Immunhistochemie verwendet werden, um die Häufigkeit der Krypten mangelhaft für Ku86 und CCOI finden. Auf dieser Rutsche, gehen wir durch eine ganze Gewebeschnitte immungefärbt für Ku86, mit einem 40x Objektiv, und wir können sehen, dass nur wenige Krypten mangelhaft für Ku86 in diesem Gewebe vorhanden sind. Auch auf dieser Folie, wir durch eine ganze Gewebeschnitte immungefärbt für CCOI, mit einem 40x Objektiv gehen, und wir können sehen, dass nur eine moderate Anzahl der Krypten mangelhaft für CCOI sind.