Détermination des tissus Utilisation de la transplantation Cap animale (ACT) Dosage dans<em> Xenopus laevis</em
Summary
Animaux bouchons surexprimant le produit du gène (s) sont transplantées dans le flanc de développement<em> Xenopus laevis</em> Embryons afin d'établir si le tissu est déterminée.
Abstract
De nombreuses protéines jouent un double rôle dans le développement embryonnaire. Celles qui régissent la détermination du destin cellulaire dans un tissu spécifique peut également affecter le développement d'une grande région de l'embryon. Cela rend la définition de son rôle dans un tissu particulier difficile à analyser. Par exemple,<em> Caboche</em> Surexpression dans<em> Xenopus laevis</em> Embryons provoque la dilatation de l'ensemble de la région antérieure, y compris l'oeil<sup> 1,2</sup>. De ce fait, on ne sait pas si Noggin joue un rôle direct dans la détermination de l'œil ou en provoquant une expansion du tissu neural, Noggin affecte indirectement la formation de l'œil. Ayant ce phénotype complexe rend l'étude de son œil le rôle spécifique dans la détermination du destin cellulaire difficiles à analyser. Nous avons développé un test qui permet de surmonter ce problème. Profitant du caractère pluripotent de l'<em> Xenopus laevis</em> Animaux bouchon<sup> 3</sup>, Nous avons développé un test pour tester l'aptitude du produit du gène (s), comme<em> Caboche</em> Ou les facteurs de transcription (oeil de champ EFTFs), pour transformer les bouchons dans un tissu particulier ou des types de cellules en transplantant ce tissu sur le côté de l'embryon<sup> 4</sup>. Bien que nous ayons constaté qu'il s'agisse du traitement de protéine Noggin ou un ensemble de facteurs de transcription peuvent déterminer le destin des cellules rétiniennes dans les calottes animales, cette procédure pourrait être utilisée pour identifier le produit du gène (s) impliqué dans la spécification d'autres tissus ainsi.
Protocol
Discussion
Dans cette vidéo, nous avons démontré notre version de techniques classiques utilisées par les biologistes de Xenopus, qui nous réarrangés pour créer le test greffe animale bouchon. A température ambiante, les embryons de xénope se développer très rapidement à travers les étapes 9 et 15. En les plaçant à 14 ° C, le développement de l'embryon est ralentie et beaucoup d'autres greffes peuvent être effectuées en une seule expérience. S'il est nécessaire d'augmenter les…
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par des subventions de recherche pour prévenir la cécité (Bourses de développement de carrière à MEZ et ASV et une subvention sans restriction à du Département d'ophtalmologie), la Fondation E. Matilda Ziegler (MEZ et ASV) et le National Eye Institute / NIH (MEZ , les subventions et R01EY015748 R01EY017964).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| mMessage mMachine SP6 Kit | Applied Biosystems/Ambion | AM1340 | ||
| Borosilicate Capillary Tubes (1.0mm OD x 0.5mm ID) | FHC, Inc | 27-30-1 | ||
| Sutter Micropipette Puller | Sutter Instruments, Inc. | P-97 | ||
| Gentamicin sulfate [50 mg/ml] | Fisher | BW17-528Z | ||
| Sylgard/elastomer Kit 1.1lb | Fisher | NC9644388 | ||
| 60 x 15 mm polystyrene petri dish | USA Scientific | 8609-0160 | ||
| human chorionic gonadotropin | Intervet | 22219 | ||
| Pico-Injector Microinjection Systems | Harvard Apparatus | 650003 | ||
| Torrey Pines Scientific ECHOtherm Incubator | Fisher | 11-680-21 | ||
| Transfer pipette | Krackeler | 6290-20635A | ||
| Dumostar #5 Forceps | Fisher | 11295-10 |
References
- Smith, W. C., Harland, R. M. Expression cloning of noggin, a new dorsalizing factor localized to the Spemann organizer in Xenopus embryos. Cell. 70, 829-840 (1992).
- Lamb, T. M. Neural induction by the secreted polypeptide noggin. Science. 262, 713-718 (1993).
- Green, J. Molecular Methods in Developmental Biology: Xenopus & Zebrafish. Methods in Developmental Biology. , (1999).
- Viczian, A. S., Solessio, E. C., Lyou, Y., Zuber, M. E. Generation of functional eyes from pluripotent cells. PLoS Biol. 7, e1000174-e1000174 (2009).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2, 905-909 (2005).
- Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller. J Vis Exp. , (2008).
- Lan, L. Noggin Elicits Retinal Fate in Xenopus Animal Cap Embryonic Stem Cells. Stem Cells. , (2009).
