Extração de DNA a partir do Micróbios Gut da térmita (Zootermopsis Angusticollis) e Visualizing micróbios do intestino

Summary

Este vídeo ilustra a técnica para a extração de DNA das espécies de micróbios residentes no intestino posterior de cupins. A preparação de uma lâmina de montagem molhada, o que é útil para visualizar a comunidade microbiana do intestino também é ilustrado, e um tour pela espécie ambiente rico intestino é dado.

Abstract

Cupins estão entre os poucos animais conhecidos por terem a capacidade de subsistir unicamente por madeira de consumo. O trato intestinal de cupins contém uma população microbiana densa e ricos em espécies que auxilia na degradação da lignocelulose predominantemente em acetato, o nutriente chave alimentando o metabolismo de cupins (Odelson & Breznak, 1983). Dentro destas populações microbianas são bactérias, archaea metanogênicas e, em alguns cupins ("menor"), eucarióticas protozoários. Assim, os cupins são sujeitos de pesquisa excelente para estudar as interações entre espécies microbianas ea inúmeras funções bioquímicas que desempenham em benefício de seus hospedeiros. A composição de espécies das populações microbianas nos intestinos de cupins, bem como os principais genes envolvidos em vários processos bioquímicos tem sido explorado através de técnicas moleculares (Kudo et al, 1998;. Schmit-Wagner et al, 2003;. Salmassi & Leadbetter, 2003). Essas técnicas dependem da extração e purificação de alta qualidade ácidos nucléicos a partir do ambiente do intestino de cupins. A técnica de extração descrita neste vídeo é uma compilação modificada de protocolos desenvolvidos para a extração e purificação de ácidos nucléicos a partir de amostras ambientais (Mor et al, 1994;. Berthelet et al, 1996;. Purdy et al, 1996;. Salmassi & Leadbetter, 2003;. Ottesen et al 2006) e que produz DNA a partir de material de cupim intestino posterior adequado para uso como modelo para a reação em cadeia da polimerase (PCR).

Protocol

Síntese do procedimento para extração de DNA de cupins de todo o intestino: Cupins frio no gelo, retire gut usando uma pinça estéril e estabilizar amostras intestino em buffer. Homogeneizar amostras em PVPP / SDS / buffer fenol. Extrair e purificar o DNA de lisado bruto usando colunas Dneasy Qiagen. Protocolo: No gelo, retire a coragem de cupins trabalhador casta usando uma pinça est…

Discussion

Em nossa experiência, o DNA extraído das comunidades microbianas de espécies de madeira alimentando-cupim como nevadensis Zootermopis é suficientemente puro para o modelo de PCR, após uma rodada de extração e purificação. No entanto, alguns cupins, tais como lixo-alimentação e no solo alimentando-espécie pode ter uma maior concentração de ácidos húmicos em seu conteúdo intestinal e pode exigir a purificação adicional de DNA microbiano intestinal. O rendimento de DNA total das entranhas de 5 trabalhadores nevadensis Z. est…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
PVPP/SDS/phenol	Buffer			homogeneization buffer
DNeasy Tissue Kit	Kit	Qiagen	77607	Used according to the protocol for isolation of genomic DNA from crude lysates (Appendix H, product manual version: July 2003)
TE	Buffer	Sigma	T9285	1x buffer (1 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0) from 100x concentrate
zirconia/silica beads	Supplies	BioSpec Products	11079101z	0.1 mm
PVPP	Reagent	Sigma	P6755	1% w/v polyvinylpolypyrrolidone prepared from dry reagent as a 1x suspension in TE buffer
Zootermopsis nevadensis	Animal			Termites
SDS	Reagent	Sigma	L4390	Sodium dodecyl sulfate 20% soln. in water from dry reagent
Phenol	Reagent	Sigma	77607	TE-saturated, ~73%
MiniBeadbeater-8	Tool	BioSpec Products	963
BSS	Buffered Salt Solution, pH 7.2			Formulation per liter: 2.5 g K2HPO4, 1.0 g KH2PO4, 1.6 g KCl, 1.4 g NaCl, 0.075 g CaCl, 1 g MgCl, and 10 mL of a 1M soln. of NaHCO3
AxioPlan-2	Microscope	Carl Zeiss, Inc. USA		Outfitted with 40x objective, 1.6x optivar and 10x ocular lenses. Samples were viewed using phase contrast illumination