Den här artikeln illustrerar den blommiga-dip metoden<em> Agrobacterium tumefaciens</em>-Medierad omvandling av<em> Arabidopsis thaliana</em>. Genom att införa en cell-cykel reglerade promotor-reporter,<em> PTSO2:: β-glukuronidas (GUS)</em>, Till<em> Arabidopsis</em>, Visar vi hur en upptäcker GUS reporter uttryck i transgena plantor.
Abstract
Den förmåga att introducera främmande gener i en organism är grunden för modern biologi och bioteknik. I modellen blommande växt<em> Arabidopsis thaliana</em>, Den blommiga-dip omvandling metod<sup> 1-2</sup> Har ersatt alla tidigare metoder grund av dess enkelhet, effektivitet och låg kostnad. Specifikt skott av unga blommande<em> Arabidopsis</em> Växter doppas i en lösning av<em> Agrobacterium tumefaciens</em> Bär specifika plasmid konstruktioner. Efter doppa, är de växter som återgått till normal tillväxt och frön avkastning, en liten del av som omvandlas med främmande gen och kan väljas för på ett medium som innehåller antibiotika. Denna blommiga-dip-metoden avsevärt underlättas<em> Arabidopsis</em> Forskning och hög grad bidragit till vår förståelse av växt geners funktion. I denna studie använder vi blommor-dip metoden att omvandla en reporter gen,<em> Β-glukuronidas (GUS)</em>, Under kontroll av<em> TSO2</em> Promotor.<em> TSO2</em>, Som kodar för ribonukleotidreduktas (RNR) liten subenhet<sup> 3</sup> Är en cellcykeln regleras gen viktigt för dNDP biosyntesen i S-fasen av cellcykeln. Granskning av<em> GUS</em> Uttryck i transgena<em> Arabidopsis</em> Plantor visar att<em> TSO2</em> Uttrycks i aktivt delande vävnad. Det redovisade experimentella metod och material kan enkelt anpassas inte bara för forskningen utan också för utbildning på gymnasiet och nivåer college.
Protocol
I. blom-dip omvandlingen av Arabidopsis thaliana Ungefär en månad före omvandling, sugga Arabidopsis frön på 4 till 8 krukor (5 cm fyrkantiga krukor) med ca 10-15 plantor per pott. För anläggningar med normal fertilitet, kommer 4 krukor med plantor per plasmid konstruktion vara tillräckligt. Om man har att förändra muterade Arabidopsis med nedsatt fertilitet, öka antalet krukor därefter. Plantorna odlas under normala förhållanden (16 tim ljus och 8 timmar mö…
Discussion
Effektiviteten i omvandlingen bestäms av många olika faktorer, som diskuteras nedan:
Hälsan hos växter och deras ålder är av största vikt. Ungefär en månad gamla anläggningar som producerar många omogna blommiga knoppar är idealiska. Trimning av primära skott för att stimulera sekundära skjuta bildandet 3-4 dagar innan förvandlingen kommer att öka omvandlingseffektiviteten. Äldre anläggningar kommer att ge upphov till transformants men i lägre takt.
Fertilitet av anläggningarn…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Chunxin Wang för att bygga pTSO2:: GUS och för foton i figur 1, Detlef Weigel för att dela GUS-idiotsäkert protokoll, Paja Sijacic och Courtney Hollender för hjälpsamma kommentarer. Forskning i Z. L laboratorium stöds av US National Science Foundation (IOB0616096 och MCB0744752). ZL är delvis stöds av University of Maryland Agricultural Experiment Station.
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
6-benzyladenine
Sigma
852430
Silwet-77
Crompton Corp.
Toxic, wear gloves
Murashige and Skoog Basal medium (MS)
Sigma
M5519
Gamborg’s vitamin solution 1000X
Sigma
G1019
X-Gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-glucuronide cyclohexamine salt