Summary

Amiloid beta-Protein, Alzheimer hastalığının etkeni Aptamers Seçimi

Published: May 13, 2010
doi:

Summary

Aptamers tarafından seçilen kısa ribo-/deoxyribo-oligonucleotides<em> In-vitro</em> Belirli bir hedef için yakınlığına göre evrim yöntemleri. Aptamers, tedavi, tanı ve araştırma çok yönlü uygulamaları ile moleküler tanıma araçları. Biz amiloid beta protein, Alzheimer hastalığının etkeni aptamers seçimi için yöntemler göstermektedir.

Abstract

Alzheimer hastalığı (AH) 1 presymptomatic tanı zor kılan sinsi bir seyir ile ilerici, yaşa bağlı, nörodejeneratif bir bozukluktur . Kesin MS tanısı, böylece AD presymptomatic, erken tanı, etkin tedaviler 2,3 geliştirmek ve yönetmek için çok önemlidir kurulması, sadece postmortem elde edilir.

Β amiloid protein (Aβ), MS patogenezinde merkezi. Çözünür, oligomerik Aβ meclisleri AD 4,5 nörotoksisite altında yatan sinaptik fonksiyon bozukluğu ve nöron kaybı etkilediğine inanılmaktadır . Çözünür Aβ meclislerinin çeşitli şekillerde tarif edilmiştir, ancak onların ilişkileri ve AD etyolojisi ve patogenezi ile ilgili karmaşık ve iyi 6 anlaşılmış değildir. Spesifik moleküler tanıma araçları Aβ meclisleri arasındaki ilişkiler çözülmeye ve belirtiler ortaya çıkmadan önce erken hastalık seyri bu meclislerin tespiti ve karakterizasyonu kolaylaştırmak. Moleküler tanıma antikorlar genellikle dayanır. Ancak, moleküler tanıma araçları, aptamers, alternatif bir sınıfı antikorların 7,8 göre önemli avantajlar sunuyor. Üstel zenginleştirme (SELEX) 9,10 ligandların sistematik evrim: Aptamers in-vitro seçim tarafından oluşturulan oligonükleotidler. SELEX Darwinci evrim benzer sağlar, iteratif bir süreç seçimi, amplifikasyon, zenginleştirme, ve devamına bir özellik, örneğin, arzulu, özel, ligand bağlanması (aptamers) veya katalitik aktivitesi (ribozimlerle rekabet ederek geçmişlerdir ve DNAzymes).

Modern biyoteknoloji ve tıp 11 aptamers araçları olarak ortaya çıkması rağmen, amiloid alanında atıl olmuştur. Birkaç RNA veya ssDNA aptamers prion proteinlerin (PrP) 12-16 çeşitli biçimlerine karşı seçilmiştir. Rekombinant sığır PrP karşı oluşturulan bir RNA aptamer amiloid fibrillerinin 18 formları tam uzunlukta PrP çözünür, polimerik, β-tabaka zengin konformasyonel varyant, sığır PrP-β 17 tanımayı gösterildi. Aptamers fibriler β 2-mikroglobulin2 m) yanı sıra, diğer bazı amiloidojenik proteinlerin β 2 m fibrillerin 19 fibriller bağlamak bulundu monomerik ve çeşitli formları kullanılarak oluşturulur. Ylera et al. immobilize monomerik Aβ40 20 karşı seçilen RNA aptamers nitelendirdi. Beklenmedik bir şekilde, bu aptamers fibriler Aβ40 bağlı. Toplamda, bu veriler, birçok önemli soruları gündeme. Neden monomerik proteinlere karşı seçilen aptamers polimerik biçimlerini biliyoruz? Amiloidojenik proteinler monomerik ve / veya oligomerik formları karşı aptamers elde edilebilir? Bu sorulara yanıt için, biz, fotoğraf kaynaklı çapraz bağlama (PICUP) 22,23 değiştirilmemiş proteinleri kullanılarak oluşturulan kovalent stabilize oligomerik Aβ40 21 aptamers seçmek için çalıştı . Önceki bulgularla 17,19,20 benzer şekilde, bu aptamers muhtemelen yapısal bir aptatope 21 potansiyel ortak amiloid tanıma Aβ ve diğer bazı amiloidojenik proteinler liflerinde tepki gösterdi. Burada, biz, bu aptamers 21 üretiminde kullanılan SELEX metodoloji mevcut .

Protocol

Bölüm 1: Protein hazırlanması ve cross-linking Başlangıçta, SELEX için kullanılan protein olarak daha önce 23 homojen, toplam ücretsiz preparatları, elde etmek için 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) ile ön işlem. Bu adım, önceden oluşmuş agrega kötü deneysel tekrarlanabilirlik 24 sonuçlanan, amiloidojenik proteinlerin hızlı agregasyonu neden çünkü gerekli, ve protein Ayrı ayrı, fibriler olmayan formları için aptamers seçimi için arz…

Discussion

SELEX sürecinin başlangıç ​​noktası, genellikle 10 12 -10 15 dizileri içeren bir rasgele oligonükleotid kütüphane sentezi . RNA SELEX, burada gösterdi ise DNA SELEX, bu kütüphane, bir ssDNA havuz oluşturulur sonra doğrudan kullanılır, ssDNA kütüphane in-vitro transkripsiyon tarafından enzimatik bir RNA havuzu ilk dönüştürülür. Sonra her döngü maruz kalma ve amaçlanan hedef için oligonükleotidler bağlayıcı oluşur sayede SELEX bağlayıcı olmayan dizile…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma, California Halk Sağlığı Bölümü'nden NIH / NIA ve 07-65798 AG030709 hibe tarafından desteklenmiştir. Peptid sentezi ve amino asit analizi, yardım ve proje destek ve reaktiflerin sağlanması için Dr Chi-Hong B. Chen ilk adımları destekleyen Dr Elizabeth F. Neufeld, ve Dr. Andrew D Margaret M. Condron kabul yararlı tartışmalar için Ellington.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
Aβ40   UCLA Biopolymers Laboratory   Lyophilized powder
MX5 Automated-S Microbalance   Mettler Toledo    
Silicon-coated, 1.6-ml tubes   Denville Scientific C19033 or C19035  
1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP)   TCI America H0424 Use in a fume hood.
Ammonium persulfate   Sigma A-7460 Vortex until the solution is clear. APS is prepared freshly each time and should be used within 48 h.
Tris(2,2-bipridyl)dichlororuthenium(II) hexahydrate   Sigma 224758-1G Vortex until the solution is clear. Cover the RuBpy tube with foil to protect the reagent from ambient light. RuBpy is prepared freshly each time and should be used within 48 h.
Dithiothreitol (DTT)   Sigma 43815  
D-Salt™ Excellulose™ desalting columns   Thermo Scientific 20449  
Ammonium acetate   Fisher Scientific A637-500  
Silicon-coated, 0.6-ml tubes   Denville Scientific C19063  
Novex Tricine Gels (10–20%)   Invitrogen EC6625B0X 10-well; mini size (8 cm X 8 cm); 25 μl loading volume per well; separation range 5 kDa to 40 kDa
Quartz cuvette   Hellma 105.250-QS  
Beckman DU 640 spectrophotometer   Beckman    
ssDNA library   Integrated DNA Technologies Custom-ordered The library was designed to contain 49 random nucleotides flanked by two constant regions containing primer-binding and cloning sites: 5′-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA ATT CCG CGT GTG C (N:25:25:25:25%) (N)49 G TCC GTT CGG GAT CCT C-3′
Taq DNA polymerase   USB Corporation 71160 Recombinant Thermus aquaticus DNA Polymerase supplied with 10× PCR Buffer and a separate tube of 25 mM MgCl2 for routine PCR.
PCR Nucleotide Mix, 10 mM solution   USB Corporation 77212 (10 mM each dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
Forward primer   Integrated DNA Technologies Custom-ordered 5′-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA ATT CCG CGT GTG C-3′
Reverse primer   Integrated DNA Technologies Custom-ordered 5′-GAG GAT CCC GAA CGG AC-3′
Thermal cycler   Denville Scientific Techne TC-312  
QIAquick PCR Purification Kit (50)   QIAGEN 28104  
Agarose   Denville Scientific CA3510-8  
Conical, sterile 1.6-ml tubes with caps attached with O-rings   Denville Scientific C19040-S  
RiboMAX™ Large Scale RNA Production System–T7   Promega P1300 The kit contains: 120 μl Enzyme Mix (RNA polymerase, recombinant RNasin® ribonuclease inhibitor and recombinant inorganic pyrophosphatase); 240 μl transcription 5 buffer; 100 μl each of 4 rNTPs, 100 mM; 110 U RQ1 RNase-free DNase, 1 U/μl; 10 μl linear control DNA, 1 mg/ml; 1 ml 3M sodium acetate (pH 5.2); 1.25 ml nuclease-Free water
α-32P-cytidine 5′-triphosphate, 250 μCi (9.25 MBq),   Perkin Elmer BLU008H250UC Specific Activity: 3000 Ci (111 TBq)/mmol, 50 mM Tricine (pH 7.6)
Citrate-saturated phenol:chloroform:isoamyl alcohol (125:24:1, pH 4.7)   Sigma (Fluka) 77619  
Chloroform:Isoamyl alcohol (24:1)   Sigma C0549  
Absolute ethanol for molecular biology   Sigma E7023  
Z216-MK refrigerated microcentrifuge   Denville Scientific C0216-MK  
illustra ProbeQuant™ G-50 Micro Columns   GE Healthcare Obtained from Fisher Scientific (45-001-487) Prepacked with Sephadex™ G-50 DNA Grade and pre-equilibrated in STE buffer containing 0.15% Kathon as Biocide
Triathler Bench-top Scintillation counter   Hidex Oy, Turku, Finland Triathler LSC Model: 425-034  
Novex® TBE-Urea Sample Buffer (2×)   Invitrogen LC6876  
6% TBE-Urea Gels 1.0 mm, 10 wells   Invitrogen EC6865BOX  
Novex® TBE Running Buffer (5×)   Invitrogen LC6675  
Radioactivity decontaminant   Fisher Scientific 04-355-67  
Gel-loading tips   Denville Scientific P3080  
XCell SureLock Mini-Cell   Invitrogen EI0001 XCell SureLock Mini-Cell
Autoradiography film   Denville Scientific E3018 Use in complete darkness
Autoradiography film, Hyperfilm™ ECL   Amersham Biosciences RPN3114K Can be used under red safe light.
Membrane discs   Millipore GSWP02500 Mixed cellulose ester, hydrophilic, 0.22-μm disc membranes
Fritted glass support base for 125-ml flask   VWR 26316-696  
Petri dishes   Fisher Scientific 08-757-11YZ  
Urea   Fisher Scientific AC32738-0050  
EDTA   Fisher Scientific 118430010  
Glycogen   Sigma G1767  
2-Propanol for molecular biology   Sigma I9516  
Recombinant RNase inhibitor   USB Corporation 71571  
ImProm-II™Reverse Transcription System   Promega A3802  
Recombinant RNase inhibitor   USB Corporation 71571  
RapidRun™ Loading Dye   USB Corporation 77524  

References

  1. Monien, B. H., Apostolova, L. G., Bitan, G. Early diagnostics and therapeutics for Alzheimer’s disease-how early can we get there. Expert. Rev. Neurother. 6, 1293-1306 (2006).
  2. Nestor, P. J., Scheltens, P., Hodges, J. R. Advances in the early detection of Alzheimer’s disease. Nat. Med. 10, S34-S41 (2004).
  3. Kawas, C. H. Clinical practice. Early Alzheimer’s disease. N. Engl. J. Med. 349, 1056-1063 (2003).
  4. Haass, C., Selkoe, D. J. Soluble protein oligomers in neurodegeneration: lessons from the Alzheimer’s amyloid β-peptide. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 8, 101-112 (2007).
  5. Kirkitadze, M. D., Bitan, G., Teplow, D. B. Paradigm shifts in Alzheimer’s disease and other neurodegenerative disorders: the emerging role of oligomeric assemblies. J. Neurosci. Res. 69, 567-577 (2002).
  6. Rahimi, F., Shanmugam, A., Bitan, G. Structure-function relationships of pre-fibrillar protein assemblies in Alzheimer’s disease and related disorders. Curr. Alzheimer Res. 5, 319-341 (2008).
  7. Jayasena, S. D. Aptamers: an emerging class of molecules that rival antibodies in diagnostics. Clin. Chem. 45, 1628-1650 (1999).
  8. Bunka, D. H., Stockley, P. G. Aptamers come of age – at last. Nat. Rev. Microbiol. 4, 588-596 (2006).
  9. Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346, 818-822 (1990).
  10. Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249, 505-510 (1990).
  11. Lee, J. F., Stovall, G. M., Ellington, A. D. Aptamer therapeutics advance. Curr. Opin. Chem. Biol. 10, 282-289 (2006).
  12. Weiss, S. RNA aptamers specifically interact with the prion protein PrP. J. Virol. 71, 8790-8797 (1997).
  13. Bibby, D. F. Application of a novel in vitro selection technique to isolate and characterise high affinity DNA aptamers binding mammalian prion proteins. J. Virol. Methods. 151, 107-115 (2008).
  14. Rhie, A. Characterization of 2′-fluoro-RNA aptamers that bind preferentially to disease-associated conformations of prion protein and inhibit conversion. J. Biol. Chem. 278, 39697-39705 (2003).
  15. King, D. J., Safar, J. G., Legname, G., Prusiner, S. B. Thioaptamer interactions with prion proteins: sequence-specific and non-specific binding sites. J. Mol. Biol. 369, 1001-1014 (2007).
  16. Proske, D. Prion-protein-specific aptamer reduces PrPSc formation. ChemBioChem. 3, 717-725 (2002).
  17. Murakami, K., Nishikawa, F., Noda, K., Yokoyama, T., Nishikawa, S. Anti-bovine prion protein RNA aptamer containing tandem GGA repeat interacts both with recombinant bovine prion protein and its β isoform with high affinity. Prion. 2, 73-80 (2008).
  18. Luhrs, T., Zahn, R., Wuthrich, K. Amyloid formation by recombinant full-length prion proteins in phospholipid bicelle solutions. J. Mol. Biol. 357, 833-841 (2006).
  19. Bunka, D. H. Production and characterization of RNA aptamers specific for amyloid fibril epitopes. J. Biol. Chem. 282, 34500-34509 (2007).
  20. Ylera, F., Lurz, R., Erdmann, V. A., Furste, J. P. Selection of RNA aptamers to the Alzheimer’s disease amyloid peptide. Biochem. Biophys. Res. Commun. 290, 1583-1588 (2002).
  21. Rahimi, F., Murakami, K., Summers, J. L., Chen, C. H., Bitan, G. RNA aptamers generated against oligomeric Aβ40 recognize common amyloid aptatopes with low specificity but high sensitivity. PLoS ONE. 4, e7694-e7694 (2009).
  22. Bitan, G., Lomakin, A., Teplow, D. B. Amyloid β-protein oligomerization: prenucleation interactions revealed by photo-induced cross-linking of unmodified proteins. J. Biol. Chem. 276, 35176-35184 (2001).
  23. Rahimi, F., Maiti, P., Bitan, G. Photo-induced cross-linking of unmodified proteins (PICUP) applied to amyloidogenic peptides. J. Vis. Exp. , (2009).
  24. Bitan, G., Fradinger, E. A., Spring, S. M., Teplow, D. B. Neurotoxic protein oligomers-what you see is not always what you get. Amyloid. 12, 88-95 (2005).
  25. Bitan, G. Structural study of metastable amyloidogenic protein oligomers by photo-induced cross-linking of unmodified proteins. Methods Enzymol. 413, 217-236 (2006).
  26. Chen, C. H., Chernis, G. A., Hoang, V. Q., Landgraf, R. Inhibition of heregulin signaling by an aptamer that preferentially binds to the oligomeric form of human epidermal growth factor receptor-3. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 9226-9231 (2003).
  27. Adams, D. S. . Lab math: a handbook of measurements, calculations, and other quantitative skills for use at the bench. , (2003).
  28. Gopinath, S. C. Methods developed for SELEX. Anal. Bioanal. Chem. 387, 171-182 (2007).
  29. Takahashi, T., Tada, K., Mihara, H. RNA aptamers selected against amyloid β-peptide (Aβ) inhibit the aggregation of Aβ. Mol. Biosyst. 5, 986-991 (2009).

Play Video

Cite This Article
Rahimi, F., Bitan, G. Selection of Aptamers for Amyloid β-Protein, the Causative Agent of Alzheimer's Disease. J. Vis. Exp. (39), e1955, doi:10.3791/1955 (2010).

View Video