Summary

Selectie van Aptameren voor amyloid β-eiwit, de verwekker van de ziekte van Alzheimer

Published: May 13, 2010
doi:

Summary

Aptameren zijn korte ribo-/deoxyribo-oligonucleotides geselecteerd door<em> In-vitro</em> Evolutie methoden op basis van affiniteit voor een specifieke doelgroep. Aptameren zijn moleculaire herkenning gereedschappen met veelzijdige therapeutische, diagnostische en wetenschappelijke toepassingen. Tonen we methoden voor de selectie van aptameren voor amyloid β-eiwit, de verwekker van de ziekte van Alzheimer.

Abstract

De ziekte van Alzheimer (AD) is een progressieve, leeftijd-afhankelijk, neurodegeneratieve aandoening met een verraderlijke cursus die maakt haar presymptomatische diagnose moeilijk 1. Definitieve diagnose AD wordt pas postmortem, dus tot oprichting van presymptomatische, vroege diagnose van AD is cruciaal voor het ontwikkelen en beheren van effectieve therapieën 2,3.

Amyloid β-eiwit (Aß) staat centraal in AD pathogenese. Oplosbaar, oligomere Aß assemblages worden verondersteld om neurotoxiciteit onderliggende synaptische dysfunctie en neuronen verlies zullen beïnvloeden in AD 4,5. Verschillende vormen van oplosbare Aß vergaderingen zijn beschreven, echter, hun onderlinge relaties en de relevantie voor AD etiologie en pathogenese zijn complex en niet goed begrepen 6. De specifieke moleculaire herkenning instrumenten kan ontrafelen van de relaties tussen Aß assemblies en vergemakkelijken detectie en karakterisatie van deze vergaderingen vroeg in het ziekteverloop voordat de symptomen ontstaan. Moleculaire herkenning vertrouwt vaak op antilichamen. Echter, een andere klasse van moleculaire herkenning tools, aptameren, biedt belangrijke voordelen ten opzichte van antilichamen 7,8. Aptameren worden oligonucleotiden gegenereerd door in-vitro selectie: systematische ontwikkeling van liganden door de exponentiële verrijking (SELEX) 9,10. SELEX is een iteratief proces dat vergelijkbaar is met de evolutietheorie van Darwin maakt selectie, versterking, verrijking, en bestendiging van een onroerend goed, bijvoorbeeld, Avid, specifieke, ligand binding (aptameren) of katalytische activiteit (ribozymen en DNAzymes).

Ondanks de opkomst van aptameren als hulpmiddelen in de moderne biotechnologie en de geneeskunde 11, zijn ze nog onvoldoende benut in het amyloid veld. Weinig RNA of ssDNA aptameren zijn geselecteerd tegen diverse vormen van prion-eiwitten (PrP) 12-16. Een RNA-aptameer gegenereerd tegen recombinant bovine PrP bleek de runder-PrP β 17 herkennen, een oplosbaar, oligomere, β-sheet-rijke conformationele variant van volledige lengte PrP dat amyloïd fibrillen 18 vormen. Aptameren gegenereerd met behulp van monomere en diverse vormen van fibrillair β 2-microglobuline2 m) bleken fibrillen bepaalde andere amyloidogenic eiwitten binden naast β 2 m fibrillen 19. Ylera et al.. beschreven RNA aptameren geselecteerd op grond van geïmmobiliseerd monomere Aβ40 20. Onverwacht, deze aptameren gebonden fibrillair Aβ40. Al met al deze gegevens maken een aantal belangrijke vragen op. Waarom heeft aptameren geselecteerd op grond van monomere eiwitten herkennen hun polymere vormen? Zou aptameren tegen monomere en / of oligomere vormen van amyloidogenic eiwitten worden verkregen? Om deze vragen te beantwoorden, hebben we geprobeerd om aptameren te selecteren voor covalent-gestabiliseerd oligomere Aβ40 21 gegenereerd met behulp van foto-geïnduceerde verknoping van niet-gemodificeerde eiwitten (PICUP) 22,23. Net als bij eerdere bevindingen 17,19,20, deze aptameren reageerde met fibrillen van Aß en enkele andere amyloidogenic eiwitten waarschijnlijk het herkennen van een mogelijk gemeenschappelijke amyloid structurele aptatope 21. Hier presenteren we de SELEX methodologie die wordt gebruikt bij de productie van deze aptameren 21.

Protocol

Deel 1: Eiwit voorbereiding en cross-linking In eerste instantie wordt het eiwit gebruikt voor SELEX voorbehandeld met 1,1,1,3,3,3-hexafluor-2-propanol (HFIP) tot homogene, totaal vrij van bereidingen, zoals eerder beschreven 23 te verkrijgen. Deze stap is nodig omdat vooraf gevormde aggregaten induceren snelle aggregatie van amyloidogenic eiwitten, wat resulteert in een slechte experimentele reproduceerbaarheid 24, en zijn ongewenst voor de selectie van aptameren voor ge…

Discussion

Het uitgangspunt van het SELEX proces is de synthese van een willekeurige oligonucleotide bibliotheek meestal met daarin 10 12 -10 15 sequenties. In DNA SELEX, deze bibliotheek direct wordt gebruikt na een ssDNA pool wordt gegenereerd, terwijl in RNA SELEX, toonde hier, is het ssDNA bibliotheek eerst omgezet in een RNA-pool enzymatisch door in-vitro transcriptie. Vervolgens wordt SELEX iteratief uitgevoerd, waarbij elke cyclus bestaat uit de belichting en binding van oligonucleotiden aan h…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door subsidies AG030709 van NIH / NIA en 07-65798 van het California Department of Public Health. Wij erkennen Margaret M. Condron voor peptide synthese en aminozuur analyse, dr. Elizabeth F. Neufeld voor het helpen en ondersteunen van de eerste stappen van het project, Dr Chi-Hong Chen B. voor het verlenen van steun en reagentia, en Dr Andrew D . Ellington voor nuttige discussies.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
Aβ40   UCLA Biopolymers Laboratory   Lyophilized powder
MX5 Automated-S Microbalance   Mettler Toledo    
Silicon-coated, 1.6-ml tubes   Denville Scientific C19033 or C19035  
1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP)   TCI America H0424 Use in a fume hood.
Ammonium persulfate   Sigma A-7460 Vortex until the solution is clear. APS is prepared freshly each time and should be used within 48 h.
Tris(2,2-bipridyl)dichlororuthenium(II) hexahydrate   Sigma 224758-1G Vortex until the solution is clear. Cover the RuBpy tube with foil to protect the reagent from ambient light. RuBpy is prepared freshly each time and should be used within 48 h.
Dithiothreitol (DTT)   Sigma 43815  
D-Salt™ Excellulose™ desalting columns   Thermo Scientific 20449  
Ammonium acetate   Fisher Scientific A637-500  
Silicon-coated, 0.6-ml tubes   Denville Scientific C19063  
Novex Tricine Gels (10–20%)   Invitrogen EC6625B0X 10-well; mini size (8 cm X 8 cm); 25 μl loading volume per well; separation range 5 kDa to 40 kDa
Quartz cuvette   Hellma 105.250-QS  
Beckman DU 640 spectrophotometer   Beckman    
ssDNA library   Integrated DNA Technologies Custom-ordered The library was designed to contain 49 random nucleotides flanked by two constant regions containing primer-binding and cloning sites: 5′-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA ATT CCG CGT GTG C (N:25:25:25:25%) (N)49 G TCC GTT CGG GAT CCT C-3′
Taq DNA polymerase   USB Corporation 71160 Recombinant Thermus aquaticus DNA Polymerase supplied with 10× PCR Buffer and a separate tube of 25 mM MgCl2 for routine PCR.
PCR Nucleotide Mix, 10 mM solution   USB Corporation 77212 (10 mM each dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
Forward primer   Integrated DNA Technologies Custom-ordered 5′-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA ATT CCG CGT GTG C-3′
Reverse primer   Integrated DNA Technologies Custom-ordered 5′-GAG GAT CCC GAA CGG AC-3′
Thermal cycler   Denville Scientific Techne TC-312  
QIAquick PCR Purification Kit (50)   QIAGEN 28104  
Agarose   Denville Scientific CA3510-8  
Conical, sterile 1.6-ml tubes with caps attached with O-rings   Denville Scientific C19040-S  
RiboMAX™ Large Scale RNA Production System–T7   Promega P1300 The kit contains: 120 μl Enzyme Mix (RNA polymerase, recombinant RNasin® ribonuclease inhibitor and recombinant inorganic pyrophosphatase); 240 μl transcription 5 buffer; 100 μl each of 4 rNTPs, 100 mM; 110 U RQ1 RNase-free DNase, 1 U/μl; 10 μl linear control DNA, 1 mg/ml; 1 ml 3M sodium acetate (pH 5.2); 1.25 ml nuclease-Free water
α-32P-cytidine 5′-triphosphate, 250 μCi (9.25 MBq),   Perkin Elmer BLU008H250UC Specific Activity: 3000 Ci (111 TBq)/mmol, 50 mM Tricine (pH 7.6)
Citrate-saturated phenol:chloroform:isoamyl alcohol (125:24:1, pH 4.7)   Sigma (Fluka) 77619  
Chloroform:Isoamyl alcohol (24:1)   Sigma C0549  
Absolute ethanol for molecular biology   Sigma E7023  
Z216-MK refrigerated microcentrifuge   Denville Scientific C0216-MK  
illustra ProbeQuant™ G-50 Micro Columns   GE Healthcare Obtained from Fisher Scientific (45-001-487) Prepacked with Sephadex™ G-50 DNA Grade and pre-equilibrated in STE buffer containing 0.15% Kathon as Biocide
Triathler Bench-top Scintillation counter   Hidex Oy, Turku, Finland Triathler LSC Model: 425-034  
Novex® TBE-Urea Sample Buffer (2×)   Invitrogen LC6876  
6% TBE-Urea Gels 1.0 mm, 10 wells   Invitrogen EC6865BOX  
Novex® TBE Running Buffer (5×)   Invitrogen LC6675  
Radioactivity decontaminant   Fisher Scientific 04-355-67  
Gel-loading tips   Denville Scientific P3080  
XCell SureLock Mini-Cell   Invitrogen EI0001 XCell SureLock Mini-Cell
Autoradiography film   Denville Scientific E3018 Use in complete darkness
Autoradiography film, Hyperfilm™ ECL   Amersham Biosciences RPN3114K Can be used under red safe light.
Membrane discs   Millipore GSWP02500 Mixed cellulose ester, hydrophilic, 0.22-μm disc membranes
Fritted glass support base for 125-ml flask   VWR 26316-696  
Petri dishes   Fisher Scientific 08-757-11YZ  
Urea   Fisher Scientific AC32738-0050  
EDTA   Fisher Scientific 118430010  
Glycogen   Sigma G1767  
2-Propanol for molecular biology   Sigma I9516  
Recombinant RNase inhibitor   USB Corporation 71571  
ImProm-II™Reverse Transcription System   Promega A3802  
Recombinant RNase inhibitor   USB Corporation 71571  
RapidRun™ Loading Dye   USB Corporation 77524  

References

  1. Monien, B. H., Apostolova, L. G., Bitan, G. Early diagnostics and therapeutics for Alzheimer’s disease-how early can we get there. Expert. Rev. Neurother. 6, 1293-1306 (2006).
  2. Nestor, P. J., Scheltens, P., Hodges, J. R. Advances in the early detection of Alzheimer’s disease. Nat. Med. 10, S34-S41 (2004).
  3. Kawas, C. H. Clinical practice. Early Alzheimer’s disease. N. Engl. J. Med. 349, 1056-1063 (2003).
  4. Haass, C., Selkoe, D. J. Soluble protein oligomers in neurodegeneration: lessons from the Alzheimer’s amyloid β-peptide. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 8, 101-112 (2007).
  5. Kirkitadze, M. D., Bitan, G., Teplow, D. B. Paradigm shifts in Alzheimer’s disease and other neurodegenerative disorders: the emerging role of oligomeric assemblies. J. Neurosci. Res. 69, 567-577 (2002).
  6. Rahimi, F., Shanmugam, A., Bitan, G. Structure-function relationships of pre-fibrillar protein assemblies in Alzheimer’s disease and related disorders. Curr. Alzheimer Res. 5, 319-341 (2008).
  7. Jayasena, S. D. Aptamers: an emerging class of molecules that rival antibodies in diagnostics. Clin. Chem. 45, 1628-1650 (1999).
  8. Bunka, D. H., Stockley, P. G. Aptamers come of age – at last. Nat. Rev. Microbiol. 4, 588-596 (2006).
  9. Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346, 818-822 (1990).
  10. Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249, 505-510 (1990).
  11. Lee, J. F., Stovall, G. M., Ellington, A. D. Aptamer therapeutics advance. Curr. Opin. Chem. Biol. 10, 282-289 (2006).
  12. Weiss, S. RNA aptamers specifically interact with the prion protein PrP. J. Virol. 71, 8790-8797 (1997).
  13. Bibby, D. F. Application of a novel in vitro selection technique to isolate and characterise high affinity DNA aptamers binding mammalian prion proteins. J. Virol. Methods. 151, 107-115 (2008).
  14. Rhie, A. Characterization of 2′-fluoro-RNA aptamers that bind preferentially to disease-associated conformations of prion protein and inhibit conversion. J. Biol. Chem. 278, 39697-39705 (2003).
  15. King, D. J., Safar, J. G., Legname, G., Prusiner, S. B. Thioaptamer interactions with prion proteins: sequence-specific and non-specific binding sites. J. Mol. Biol. 369, 1001-1014 (2007).
  16. Proske, D. Prion-protein-specific aptamer reduces PrPSc formation. ChemBioChem. 3, 717-725 (2002).
  17. Murakami, K., Nishikawa, F., Noda, K., Yokoyama, T., Nishikawa, S. Anti-bovine prion protein RNA aptamer containing tandem GGA repeat interacts both with recombinant bovine prion protein and its β isoform with high affinity. Prion. 2, 73-80 (2008).
  18. Luhrs, T., Zahn, R., Wuthrich, K. Amyloid formation by recombinant full-length prion proteins in phospholipid bicelle solutions. J. Mol. Biol. 357, 833-841 (2006).
  19. Bunka, D. H. Production and characterization of RNA aptamers specific for amyloid fibril epitopes. J. Biol. Chem. 282, 34500-34509 (2007).
  20. Ylera, F., Lurz, R., Erdmann, V. A., Furste, J. P. Selection of RNA aptamers to the Alzheimer’s disease amyloid peptide. Biochem. Biophys. Res. Commun. 290, 1583-1588 (2002).
  21. Rahimi, F., Murakami, K., Summers, J. L., Chen, C. H., Bitan, G. RNA aptamers generated against oligomeric Aβ40 recognize common amyloid aptatopes with low specificity but high sensitivity. PLoS ONE. 4, e7694-e7694 (2009).
  22. Bitan, G., Lomakin, A., Teplow, D. B. Amyloid β-protein oligomerization: prenucleation interactions revealed by photo-induced cross-linking of unmodified proteins. J. Biol. Chem. 276, 35176-35184 (2001).
  23. Rahimi, F., Maiti, P., Bitan, G. Photo-induced cross-linking of unmodified proteins (PICUP) applied to amyloidogenic peptides. J. Vis. Exp. , (2009).
  24. Bitan, G., Fradinger, E. A., Spring, S. M., Teplow, D. B. Neurotoxic protein oligomers-what you see is not always what you get. Amyloid. 12, 88-95 (2005).
  25. Bitan, G. Structural study of metastable amyloidogenic protein oligomers by photo-induced cross-linking of unmodified proteins. Methods Enzymol. 413, 217-236 (2006).
  26. Chen, C. H., Chernis, G. A., Hoang, V. Q., Landgraf, R. Inhibition of heregulin signaling by an aptamer that preferentially binds to the oligomeric form of human epidermal growth factor receptor-3. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 9226-9231 (2003).
  27. Adams, D. S. . Lab math: a handbook of measurements, calculations, and other quantitative skills for use at the bench. , (2003).
  28. Gopinath, S. C. Methods developed for SELEX. Anal. Bioanal. Chem. 387, 171-182 (2007).
  29. Takahashi, T., Tada, K., Mihara, H. RNA aptamers selected against amyloid β-peptide (Aβ) inhibit the aggregation of Aβ. Mol. Biosyst. 5, 986-991 (2009).

Play Video

Cite This Article
Rahimi, F., Bitan, G. Selection of Aptamers for Amyloid β-Protein, the Causative Agent of Alzheimer's Disease. J. Vis. Exp. (39), e1955, doi:10.3791/1955 (2010).

View Video