ΓH2AX foci के Ionising विकिरण करने के लिए प्रत्युत्तर में मात्रा का ठहराव
Summary
डीएनए डबल भूग्रस्त एक आणविक मार्कर के रूप में γH2AX गठन का उपयोग धारियाँ की मात्रा का ठहराव विकिरण जीव विज्ञान में एक अमूल्य उपकरण बन गया है. यहाँ हम γH2AX foci के विकिरण के कक्षों के प्रदर्शन के बाद मात्रा का ठहराव के लिए एक immunofluorescence परख के उपयोग के प्रदर्शन.
Abstract
डीएनए डबल भूग्रस्त (DSBs) टूट जाता है, जो या तो अंतर्जात चयापचय प्रक्रियाओं के द्वारा या exogenous स्रोतों द्वारा प्रेरित कर रहे हैं और जीनोमिक अखंडता के अस्तित्व के संरक्षण के लिए सम्मान के साथ एक सबसे महत्वपूर्ण डीएनए घावों के कर रहे हैं. DSBs की प्रेरण के लिए एक प्रारंभिक प्रतिक्रिया H2A histone संस्करण, H2AX की phosphorylation सेरीन-139 अवशेषों पर, उच्च संरक्षित सी टर्मिनल SQEY आकृति में, बनाने γH2AX<sup> 1</sup>. DSBs की प्रेरण के बाद, H2AX तेजी से 3-kinase phosphatidyl – inosito (PIKK) प्रोटीन के परिवार, गतिभंग telangiectasia उत्परिवर्तित (एटीएम), डीएनए प्रोटीन kinase उत्प्रेरक सबयूनिट और एटीएम और RAD3 से संबंधित द्वारा phosphorylated है (एटीआर)<sup2></sup>. आमतौर पर, केवल कुछ बेस जोड़े (बीपी) के एक DSB में फंसा रहे हैं डीएनए की क्षति संकेतन और मरम्मत में chromatin संशोधन के महत्व को देखते हुए, तथापि, वहाँ महत्वपूर्ण संकेत प्रवर्धन है,. H2AX की phosphorylation chromatin के आसन्न क्षेत्रों के लिए एटीएम फैलता द्वारा मुख्य रूप से मध्यस्थता, DSB अनुसार कुल सेलुलर H2AX के लगभग 0.03% को प्रभावित<sup2,3></sup>. यह लगभग 2000 H2AX ~ 2 chromatin की MBP DSB और असतत γH2AX foci के गठन में परिणाम की साइट है जो आसानी से कल्पना और immunofluorescence माइक्रोस्कोपी द्वारा quantitated किया जा सकता है आसपास के क्षेत्रों में फैले अणुओं की phosphorylation से मेल खाती है है<sup2></sup>. DSB पर γH2AX के नुकसान की मरम्मत को दर्शाता है, तथापि, वहाँ क्या DSBs की पूरी मरम्मत परिभाषित करने के रूप में कुछ विवाद है, यह प्रस्ताव किया गया है कि डीएनए के दोनों किस्में के फिर से शामिल पर्याप्त तथापि, यह भी सुझाव दिया गया है कि पुनः – instatement संघनन की मूल chromatin राज्य आवश्यक है<sup> 4-8</sup>. γH2AX के disappearence कम से कम हिस्से में शामिल है, phosphatases, फॉस्फेट 2A और फॉस्फेट 4C द्वारा dephosphorylation<sup5,6></sup>. इसके अलावा, γH2AX के पुनर्वितरण के द्वारा हटाने H2A.Z साथ histone विनिमय शामिल फंसाया गया है<sup7,8></sup>. महत्वपूर्ण बात, γH2AX foci के मात्रात्मक विश्लेषण चिकित्सा और परमाणु अनुसंधान के क्षेत्र में आवेदनों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए नेतृत्व किया गया है. यहाँ, हम γ विकिरणित पक्षपाती मानव keratinocytes में पता लगाने और γH2AX foci के quantitation द्वारा प्रारंभिक डीएनए की क्षति के मूल्यांकन के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया immunofluorescence विधि का प्रदर्शन<sup9></sup>.
Protocol
Discussion
Ionizing विकिरण (γ रे), γH2AX foci तेजी फार्म और foci संख्या के बाद जोखिम 3-60 2 मिनट के बीच एक अधिकतम तक पहुँचने. इसलिए, हमारे 1 घंटे के समय के बाद विकिरण बिंदु प्रारंभिक DSB गठन को दर्शाता है. हम अपने प्रयोग के लिए नैदानिक ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
परमाणु विज्ञान और इंजीनियरिंग के ऑस्ट्रेलियाई संस्थान का समर्थन स्वीकार किया है. TCK AINSE पुरस्कार के प्राप्तकर्ता था. Epigenomic चिकित्सा लैब राष्ट्रीय स्वास्थ्य और ऑस्ट्रेलिया के चिकित्सा अनुसंधान परिषद (566,559) द्वारा समर्थित है. LM मेलबोर्न (मेलबोर्न विश्वविद्यालय) अनुसंधान और बायोमेडिकल इमेजिंग सीआरसी अनुपूरक छात्रवृत्ति के द्वारा समर्थित है. मोनाश माइक्रो इमेजिंग के समर्थन (डीआरएस स्टीफन कोड़ी और Iśka Carmichael) इस काम के लिए अमूल्य था.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Keratinocyte-Serum Free Medium (K-SFM) | Media | Invitrogen | 17005042 | Keratinocyte media supplemented with human recombinant Epidermal Growth Factor 1-53 (EGF 1-53), and Bovine Pituitary Extract (BPE). |
| Lab Tek lI Chamber Slides (8-well) | Chamber Slides | Nunc Denmark | NUN154534 | |
| Coverslips (22x50mm) | Coverslips | Menzel-Gläser | CS2250100 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | BSA (1%) is used to block any non-specific antibody binding. Primary and secondary antibodies are diluted in BSA. | |
| PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 17-517Q | ||
| 0.5% Trypsin-EDTA x10 | Invitrogen | 15400-054 | Trypsin-EDTA (0.05%) used to detach cells from culture flasks. | |
| Triton X-100 | Reagent | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 (0.1%) used to permeabilise cells. |
| Paraformaldehyde | Reagent | Sigma-Aldrich | 158127 | Paraformaldehyde (4%) used to fix cells. |
| Mouse monoclonal anti-phospho histone-H2AX antibody | Primary Antibody | Millipore | 16193 | Dilution of primary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Secondary Antibody | Invitrogen | 11029 | Dilution of secondary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| TOPRO3 | DNA Stain | Invitrogen | T3605 | DNA stain commonly used: 4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI). Can only be used with microscopes with the appropriate excitation laser. |
| ProLong Gold | Anti-fade solution | Invitrogen | P36930 | Refractive index of 1.42 at 20°C. |
| Tissue Culture Flask, Vented Cap | Culture Flask | BD Falcon | 353112 | |
| Tissue Culture Dish (150x25mm) | Petridish | BD Falcon | 353025 | |
| Coplin Jar, glass | Grale Scientific P/L | 1771-OG | ||
| Staining Trough | Grale Scientific P/L | V1991.99 | ||
| Gammacell 1000 Elite Irradiator | Gamma Irradiator | Nordion International Inc. | ||
| Zeiss LSM 510 Meta Confocal | Confocal Microscope | |||
| Metamorph | Software for Imaging analysis | Molecular Devices, USA |
References
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