Ionising 방사선에 대한 응답으로 γH2AX Foci의 부량
Summary
분자 마커로 γH2AX 형성을 사용하여 DNA 이중 스트랜드 줄무늬의 부량 방사선 생물학에서 매우 중요한 도구가되었습니다. 여기 우리는 방사선에 노출 후 세포의 γH2AX foci의 부량위한 immunofluorescence 분석의 사용을 보여줍니다.
Abstract
내생 신진 대사 과정 중 또는 외인성 소스에 의해 유도된 아르 DNA 이중 가닥 나누기 (DSBs)는, 게놈 무결성 생존과 보존에 관한 가장 중요한 DNA의 병변 중 하나입니다. DSBs의 유도에 초기 반응은 γH2AX을 형성, 높은 보존 C – 터미널 SQEY의 모티브에서 세린 – 139 잔여물에서 H2A 히스톤 변형, H2AX의 인산화입니다<sup> 1</sup>. DSBs의 유도에 따라, H2AX는 빠르게 phosphatidyl – inosito 3 키나제 (PIKK) 단백질의 가족 운동 실조증 telangiectasia 변이된 (ATM), DNA – 단백질 키나제 촉매 subunit와 ATM과 RAD3 관련하여 phosphorylated입니다 (ATR)<sup> 2</sup>. 일반적으로 단지 몇베이스 쌍 (BP)은 DNA 손상 신호 및 수리에 염색질 수정의 중요성을 감안할 때, 그러나, 중요한 신호 증폭이, DSB에 연루됩니다. H2AX의 인산화는 DSB 당 전체 세포 H2AX의 약 0.03 %에 영향을 미치는, 염색질의 인접 지역에 ATM 확산에 의해 주로 중재<sup> 2,3</sup>. 이것은 쉽게 시각과 immunofluorescence 현미경에 의해 quantitated 수있는 DSB와 이산 γH2AX foci 형성의 결과의 사이트를 둘러싼 염색질의 ~ 2 MBP 영역을 걸쳐 약 2000 H2AX 분자의 인산화에 해당하는<sup> 2</sup>. DSB에 γH2AX의 손실 복구를 반영하지만, DSBs의 완전한 복구를 정의하는 무엇 같은 논쟁이있다, 그것은 DNA의 양쪽 가닥이 복귀하는 것은 그러나 적절한 것을 제안되었습니다, 그것은 또한 제안되었음을에 다시 instatement 압축의 원래 염색질 상태가 필요합니다<sup> 4-8</sup>. γH2AX의 disappearence 적어도 부분적으로 포함, phosphatases, 인산 가수 분해 효소 2A 및 인산 가수 분해 효소 4C에 의해 dephosphorylation<sup> 5,6</sup>. 또한, H2A.Z와 히스톤 교류를 포함한 재배포하여 γH2AX의 제거가 연루되어있다<sup> 7,8</sup>. 중요한 것은 γH2AX foci의 정량 분석은 의료 및 핵 연구에 응용 프로그램의 다양한되었다. 여기서는 γ – 반구 자기편 인간 keratinocytes에서 γH2AX foci의 탐지 및 quantitation에 의해 초기의 DNA 손상 평가를 위해 가장 일반적으로 사용되는 방법을 보여주 immunofluorescence<sup> 9</sup>.
Protocol
Discussion
이온화 방사선 (γ 선), 빠르게 γH2AX foci 양식 및 foci 번호를 다음 노출 30~60분 2 사이 최대에 도달. 따라서, 우리 1시간 후 방사선 시점은 초기 DSB 형성을 반영합니다. 우리는 우리의 실험 2 쥐의 임상 관련 방사선 선량을 사용했습니다. 그러나 방법은 초기 DSB 형성의 검출 4 쥐 위해 방사선 접종에 사용할 수있는, foci 상당한 중복 높은 복용에 정확한 quantitation 걸로. γH2AX foci가 같지는 숫자 결?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
원자력 과학 및 공학의 호주 연구소의 지원 인정받고 있습니다. TCK는 AINSE 보너스받는했다. Epigenomic 의학 연구소는 국민 건강과 호주의 의료 연구위원회 (566559)에 의해 지원됩니다. LM은 멜버른 연구 (멜버른 대학)와 바이오 메디컬 이미징 CRC의 보조 장학금으로 지원됩니다. 모나 마이크로 이미징의 지원 (DRS 스티븐 코디 Iśka 카마 이클)이 작품 소중한했다.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Keratinocyte-Serum Free Medium (K-SFM) | Media | Invitrogen | 17005042 | Keratinocyte media supplemented with human recombinant Epidermal Growth Factor 1-53 (EGF 1-53), and Bovine Pituitary Extract (BPE). |
| Lab Tek lI Chamber Slides (8-well) | Chamber Slides | Nunc Denmark | NUN154534 | |
| Coverslips (22x50mm) | Coverslips | Menzel-Gläser | CS2250100 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | BSA (1%) is used to block any non-specific antibody binding. Primary and secondary antibodies are diluted in BSA. | |
| PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 17-517Q | ||
| 0.5% Trypsin-EDTA x10 | Invitrogen | 15400-054 | Trypsin-EDTA (0.05%) used to detach cells from culture flasks. | |
| Triton X-100 | Reagent | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 (0.1%) used to permeabilise cells. |
| Paraformaldehyde | Reagent | Sigma-Aldrich | 158127 | Paraformaldehyde (4%) used to fix cells. |
| Mouse monoclonal anti-phospho histone-H2AX antibody | Primary Antibody | Millipore | 16193 | Dilution of primary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Secondary Antibody | Invitrogen | 11029 | Dilution of secondary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| TOPRO3 | DNA Stain | Invitrogen | T3605 | DNA stain commonly used: 4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI). Can only be used with microscopes with the appropriate excitation laser. |
| ProLong Gold | Anti-fade solution | Invitrogen | P36930 | Refractive index of 1.42 at 20°C. |
| Tissue Culture Flask, Vented Cap | Culture Flask | BD Falcon | 353112 | |
| Tissue Culture Dish (150x25mm) | Petridish | BD Falcon | 353025 | |
| Coplin Jar, glass | Grale Scientific P/L | 1771-OG | ||
| Staining Trough | Grale Scientific P/L | V1991.99 | ||
| Gammacell 1000 Elite Irradiator | Gamma Irradiator | Nordion International Inc. | ||
| Zeiss LSM 510 Meta Confocal | Confocal Microscope | |||
| Metamorph | Software for Imaging analysis | Molecular Devices, USA |
References
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- Dickey, J. H2AX: functional roles and potential applications. Chromosoma. , (2009).
