Undersökning av Telomer G-överhäng Struktur i Trypanosoma brucei</em
Summary
Telomererna är avgörande för kromosom stabiliteten och telomeren G-överhäng struktur är viktigt för telomeras-medierad telomer underhåll. Vi har nyligen antagit två metoder för att upptäcka telomeren G-överhäng struktur i<em> Trypanosoma brucei</em>, Som är infödd i-gel hybridisering och ligation-medierade primer förlängning, som kommer att beskrivas.
Abstract
Den telomeren G-överhäng struktur har identifierats i många eukaryoter, inklusive jäst, ryggradsdjur, och Trypanosoma brucei. Det fungerar som substrat för telomeras för de novo telomer-DNA syntes och är därför viktig för telomererna underhåll. T. brucei är en protozo parasit som orsakar sömnsjuka hos människor och nagana hos nötkreatur. När smittade däggdjur värd, T. brucei cellen byter regelbundet sina ytantigen att undkomma värdens immunförsvar attack. Vi har nyligen visat att T. brucei telomeren struktur spelar en viktig roll i regleringen av ytantigen genuttryck, vilket är avgörande för T. brucei patogenes. Men T. brucei telomeren struktur har inte studerats på grund av begränsningar i metoder för analys av denna specialiserade struktur. Vi har nu framgångsrikt antagit de infödda i-gel hybridisering och ligation-medierade primer metoder förlängning för undersökning av telomer G-överhäng struktur och en adapter ligation metod för bestämning av telomer terminalen nukleotid i T. brucei celler. Här kommer vi att beskriva de protokoll i detalj och jämföra deras olika fördelar och begränsningar.
Protocol
Discussion
Trypanosoma brucei orsakar sömnsjuka hos människor. Denna sjukdom, om den lämnas obehandlad, oundvikligen till döden. T. brucei celler i däggdjur värd genomgår antigen variation regelbundet så att kringgå värdens immun attack 7. Därför är det mycket svårt att eliminera T. brucei celler när en infektion är etablerad. Vi har nyligen visat att telomererna spelar en viktig roll i regleringen av uttrycket av T. brucei ytantigen gen 8. Därför är det …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka Dr Carolyn Pris för vetenskapliga diskussioner och förslag insiktsfulla. Detta arbete stöds av NIH bidrag AI066095 (PI: Bibo Li).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | ||
| Agarose Type VII (low melting agarose) | Sigma | A4018 | ||
| Proteinase K, recombinant, PCR grade | Roche Diagnostic | 03 115801001 | ||
| Exo I | NEB | M0293 | ||
| Exo T | NEB | M0265 | ||
| T7 exonuclease | NEB | M0263 | ||
| T4 DNA polymerase | NEB | M0203 | ||
| QIAquick nucleotide removal kit | Qiagen | 28304 |
References
- Munoz-Jordan, J. L., Cross, G. A., de Lange, T., Griffith, J. D. t-loops at trypanosome telomeres. EMBO J. 20, 579-588 (2001).
- Li, B., Espinal, A., Cross, G. A. M. Trypanosome telomeres are protected by a homologue of mammalian TRF2. Mol Cell Biol. 25, 5011-5021 (2005).
- Wellinger, R. J., Wolf, A. J., Zakian, V. A. Saccharomyces telomeres acquire single-strand TG1-3 tails late in S phase. Cell. 72, 51-60 (1993).
- McElligott, R., Wellinger, R. J. The terminal DNA structure of mammalian chromosomes. EMBO J. 16, 3705-3714 (1997).
- Harrington, L. A., Greider, C. W. Telomerase primer specificity and chromosome healing. Nature. 353, 451-454 (1991).
- Jacob, N. K., Skopp, R., Price, C. M. G-overhang dynamics at Tetrahymena telomeres. Embo J. 20, 4299-4308 (2001).
- Barry, J. D., McCulloch, R. Antigenic variation in trypanosomes: enhanced phenotypic variation in a eukaryotic parasite. Adv Parasitol. 49, 1-70 (2001).
- Yang, X., Figueiredo, L. M., Espinal, A., Okubo, E., Li, B. RAP1 is essential for silencing telomeric variant surface glycoprotein genes in Trypanosoma brucei. Cell. 137, 99-109 (2009).
