マイクロパターン化表面でのタンパク質間相互作用の in vivo検出

Summary

このビデオでは、マイクロパターン化表面を使用することにより、タンパク質 – タンパク質相互作用のその後の分析と実験を示しています。アプローチは、生きた細胞でタンパク質間相互作用を検出する可能性を提供し、定量的な情報を抽出する可能性が高いスループット能力を兼ね備えています。

Abstract

分子の相互作用のネットワークを解明<em>生体内</em>細胞機能と代謝の制御機構を理解する鍵である。細胞内の分子間相互作用に対処するための方法論的な多数のオプションが開発されたが、これらのメソッドのほとんどは、ほとんど定量的ではなく、間接的、従ってであることに苦しんでされています。逆に、少数のハイエンド定量的アプローチは、しかし、高いスループットに拡張することが困難である、導入されました。定量的な情報を抽出する可能性が高いスループット能力を結合するには、我々は最近、タンパク質間相互作用を識別するための新しいコンセプトを（Schwarzenbacher開発<em>ら</em>。、2008）。ここで、我々はデザインと蛍光標識タンパク質（"獲物"）と膜タンパク質（"餌"）との間の相互作用を分析することを可能にするこのシステムの構築のための詳細なプロトコルを記述する<em>生体内</em>。細胞は、餌exoplasmicドメインに対する抗体で機能化マイクロパターン表面上にメッキされています。餌 – 獲物相互作用は、蛍光獲物の再分配を経由してアッセイされる。方法は、スクリーニングツールとしてそれが適用されること、ダウン、単一分子のレベルまで高感度、弱い相互作用を検出する能力、および高いスループット能力によって特徴づけられる。

Protocol

マイクロコンタクトプリンティング： メスを用いてPDMSスタンプの微細のフィールドをカットエタノール（100％）と蒸留水でそれをフラッシュすることにより微細を含むフィールドを洗ってください。 窒素またはアルゴンガスでPDMSスタンプを乾かします。 ピペットを50μlBSA – Cy5と仕事のソリューション（0.67 mg / ml）をPDMSスタンプ上に全体の微細フィールドが溶液で覆われるように。室温で30分間インキュベートする。 リン酸でそれをフラッシュすることにより微細フィールドを洗うには、生理食塩水（PBS）と蒸留水をバッファ。 窒素またはアルゴンガスでPDMSを乾かします。 個のエポキシコーティングされたカバースリップの途中に自重でPDMSスタンプを配置し、ペトリ皿の中で、室温で30分間インキュベートする。 カバーの裏面にPDMSスタンプの位置にラベルを付け、ピンセットを用い、スライドからスタンプを取り除く。 カバースリップ上にマイクロコンタクト印刷されたフィールドを介してセキュアシールのハイブリダイゼーションチャンバーを貼る。ラベルは、フィールドの中心をローカライズするのに役立ちます。 ピペット60μlのストレプトアビジンの作業溶液（50μg/ ml）を反応室に、室温で60分間サンプルをインキュベートする。 チャンバーの一方のポートにバッファを追加し、ポンプで2番目のポートで同時にそれを除去することによって1mlのPBSでサンプルを洗浄してください。 ピペット60μlのビオチン化抗体の作業溶液（10μgの/ 0.1％ツイーン20を添加したPBS中、"PBST"）室温で60分間反応チャンバとインキュベートに。 チャンバーの一方のポートにバッファを追加し、ポンプで2番目のポートで再びそれを削除することによって、1 mlのPBSTと続いて1mlのPBSでサンプルを洗浄してください。 細胞が播種するための準備が整うまでは、暗所、室温でPBSでマイクロパターン表面を保管してください。 マイクロパターン表面への細胞のインキュベーション： 3cmの組織培養プレートで50％コンフルエントに接着細胞を成長させる。 エチレンジアミン四酢酸（EDTA）溶液で関心の餌と獲物タンパク質を発現する細胞を剥​​離し、1,000 rpmで5分遠心してください。 上清を捨て、応じて増殖培地中で細胞ペレットを溶解する。 1,000 rpmで5分間遠心操作する。 上清を捨て、適切な増殖培地中で細胞ペレットを溶解する。 交換細胞懸濁液60μlのでマイクロパターンのカバースリップ上で反応チャンバーからPBS。 蒸留水で滅菌パッドを浸漬し、乾燥した実行サンプルを防ぐために、ペトリ皿にそれを置くことによって加湿チャンバーを作成します。 37泊以上の細胞をインキュベートしますマイクロパターン表面上に、5％CO 2雰囲気でC。 のCa 2 +およびMg 2 +を含むハンクスのバッファ塩溶液による顕微鏡、交換培地上の細胞を分析する前に。 顕微鏡： カバースリップを適切なマウントで配置され、細胞の形態は、白色光下でチェックされます。 BSA – Cy5のパターンの品質は、647 nmで励起によってチェックされます。 蛍光preyタンパク質（GFPまたはYFP）の微細パターンは、全反射（TIR）励起の下で488または514 nmで記録されます。 代表的な結果： マイクロパターン表面上に成長させた細胞中の標的タンパク質間の相互作用がある場合は、獲物が餌の再分配に従います。結果として得られる微細はpreyタンパク質の蛍光標識によって可視化することができる。重要なのは得られるコントラストは、相互作用の強さを直接測定（図1参照）を提供しています。したがって、2つのタンパク質の相互作用の簡易評価が可能となる – さらに、測定主要なデータを処理するために必要なし。 図1。異なる相互作用強度で生細胞の原形質膜中の餌の転位。 CD59抗体microbiochipsでTIRのCD71抗体で（A）CD71 – GFPをトランスフェクションしたT24細胞の画像、（B）CD4およびCD4抗体で細胞質YFPと（C）GPI – GFP – DAFが表示されます。データは、（）強いの特性がない（b）または弱い相互作用（c）があります。 （A）（Weghuber ら 、印刷中）、（B）（Schwarzenbacher ら 、2008）からから再生される。

Discussion

付属のビデオでは、生きた細胞の血漿膜（。。Brameshuber ら 、2009;。。Weghuber ら 、 印刷中 Schwarzenbacher ら 、2008）におけるタンパク質間相互作用を検出する方法を示しています。原則として、いかなるTIRFベースの顕微鏡のプラットフォームは、読み出しシステムとして使用することができます。高感度は（単一分子の検出用など）が必要なときにのみ、高度な顕微鏡が必要になります。最良の結果を達成するための準備処理中に、次の重要な点は特別な注意が必要です。

1. 暗条件下でのストアでは、Cy5標識ストック溶液蛍光体の漂白を避けるとマイクロコンタクトプリンティングの前にたてBSA – Cy5と作業溶液を調製する。
2. ピペットの先端でPDMSにマイクロパターンを掻くと蛍光体の漂白を避けるために暗い条件下でサンプルをインキュベートしないように注意してください。
3. ペトリ皿にガラスのスライドの固着を防ぐために、滅菌パッドの上にカバースリップを置く。 PDMSスタンプは、スライドガラスに付着したら、それを移動しないでください。
4. 反応室内の空気の泡を避け、蛍光団の漂白を避けるために暗い条件下でサンプルをインキュベートする。
5. 塩の結晶の形成を避けるために2分以上のサンプルを乾燥させないでください。
6. 細胞の剥離用としてトリプシンを使用しないでください、それを切断するには、これまでに発現する膜タンパク質の細胞外ドメインなります。トリプシンを避けることがすぐに表面上の細胞の付着後に微細パターンを形成するために低離職率を持つタンパク質の参考になります。
7. 顕微鏡でインキュベートした細胞の数を制御し、細胞がより30-50％コンフルエントに達していないことを確認してください。過剰な細胞が原因で抗体でコーティングされた表面上の細胞の高速アタッチメントにすぐに削除されていることを確認します。
8. 高品質のBSA – Cy5のパターンを持つ唯一のスライドは、さらなる分析のために使用することができます。
9. 蛍光preyタンパク質の安定した発現が原因で、スキャンごとに分析することができるセルの数が多いのが望ましい。
10. 十分な全反射の調整は、細胞質背景に起因するパターンを可視化することが不可欠である。

マイクロパターニング技術は、タンパク質 – タンパク質相互作用の分析のためのいくつかの可能性を提供しています。まず、ローカル、空間分解タンパク質間相互作用の定量化と一緒にも弱いまたは間接的な相互作用の検出は、偽陽性または陰性の高い数を与えることの欠点なしで可能です。第二にそれは2 – ハイブリッドスクリーンのような生化学的なアプローチによって達成することは困難である生きた細胞の血漿膜にタンパク質間相互作用を分析する研究が可能になります。第三のアプローチは、温度などの環境変化、​​異なるタンパク質または他の分子や翻訳後修飾の存在によって変調される餌と被食者相互作用の検出が可能になります。したがって、このアッセイは、生細胞のコンテキスト内の指定された相互作用のペアのスクリーニング変調が可能になります。さらに、捕獲リガンドまたは一価のリガンドの使用の面密度を低減することにより、静止状態の解析が可能となる。適切なスキャンのプラットフォームが使用されている場合、最終的には、分析セルの数は、薬物スクリーニングのための製薬企業の高スループット要求（ラム、2005）と一致するのに十分高いです。