Etikettering en Imaging Cellen in de zebravis achterhersenen
Summary
De sleutel tot het begrijpen van de morfogenetische processen die de vroege embryo vorm is de mogelijkheid om beeld-cellen met een hoge resolutie. We beschrijven hier een techniek voor het etiketteren van enkele cellen of kleine clusters van cellen in zijn geheel zebravis embryo's met membraan-gerichte Green Fluorescent Protein.
Abstract
De sleutel tot het begrijpen van de morfogenetische processen die de vroege gewervelde embryo vorm is de mogelijkheid om beeld-cellen met een hoge resolutie. In de zebravis embryo's, injectie van plasmide DNA resulteert in een mozaïek expressie, waardoor voor de visualisatie van losse cellen of kleine clusters van cellen<sup> 1</sup>. We beschrijven hoe de injectie van plasmide DNA dat codeert voor membraan-gerichte Green Fluorescent Protein (mGFP) onder de controle van een alomtegenwoordige promotor kan worden gebruikt voor beeldvorming cellen ondergaan neurulatie. Centraal in dit protocol is de methodologie voor de beeldvorming gelabelde cellen met een hoge resolutie in secties en ook in real time. Dit protocol omvat de injectie van DNA in mGFP jonge zebravis embryo's. Embryo's worden vervolgens verwerkt voor vibratome snijden, antilichaam labeling en beeldvorming met een confocale microscoop. Als alternatief kan levende embryo's te drukken mGFP worden afgebeeld met behulp van time-lapse confocale microscopie. We hebben eerder gebruik gemaakt van deze eenvoudige benadering van de cellulaire gedrag dat neurale buis formatie rijden in de achterhersenen regio zebravis embryo's te analyseren<sup> 2</sup>. De vaste voorbereidingen toegestaan voor ongekende visualisatie van cellen vormen en organisatie in de neurale buis, terwijl live-imaging aangevuld deze aanpak waardoor een beter begrip van de cellulaire dynamiek die plaatsvinden tijdens neurulatie.
Protocol
Discussion
Kortom, de etikettering hier beschreven technieken zorgen voor enkele cel analyse van morfogenetische processen in de zebravis embryo. De primaire nadruk van dit protocol is over de methoden voor de beeldvorming gelabelde cellen in de neurale buis met behulp van mGFP onder de controle van een alomtegenwoordige promotor. Voor extra toepassingen van deze transiënte expressie test lezers worden verwezen naar een recent artikel van Andersen et al.. 3.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door een NIH subsidie toegekend aan R. Brewster (1R01GM085290-01A1).
Materials
Solutions
- Hank’s Stock #1: 8.0 g NaCl , 0.4 g KCl in 100 ml dd H2O
- Hank’s Stock #2: 0.358 g Na2HPO4 Anhydrous, 0.60 g KH2PO4 in 100 ml ddH2O
- Hank’s Stock #4: 0.72 g CaCl2 in 50 ml ddH2O
- Hank’s Stock #5: 1.23 g MgSO4x7H2O in 50 ml dd H2O
- 1 X Phosphate Buffer: 0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.02 M PO4, pH 7.3
- Blocking Solution: 2% normal goat serum, 1% bovine serum albumin (BSA), 1% dimethysulfoxide (DMSO)
References
- Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish Practical approach series. , (2002).
- Hong, E., Brewster, R. N-cadherin is required for the polarized cell behaviors that drive neurulation in the zebrafish. Development. 133, 3895-3905 (2006).
- Andersen, E., Asuri, N., Clay, M., Halloran, M. Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos. J Vis Exp. , (2010).
