Summary
La méthode présentée ici permet d’évaluer l’effet des réactifs sur l’angiogenèse ou la perméabilité vasculaire in vivo sans coloration. La méthode utilise l’injection de dextran-FITC via la veine de la queue pour visualiser les néo-vaisseaux ou les fuites vasculaires.
Abstract
Plusieurs modèles ont été développés pour étudier l’angiogenèse in vivo. Cependant, la plupart de ces modèles sont complexes et coûteux, nécessitent un équipement spécialisé ou sont difficiles à réaliser pour une analyse quantitative ultérieure. Nous présentons ici un test de bouchon de gel matriciel modifié pour évaluer l’angiogenèse in vivo. Dans ce protocole, les cellules vasculaires ont été mélangées à du gel matriciel en présence ou en l’absence de réactifs pro-angiogéniques ou anti-angiogéniques, puis injectées par voie sous-cutanée dans le dos de souris receveuses. Après 7 jours, une solution saline tampon phosphate contenant du dextran-FITC est injectée par la veine de la queue et circule dans des vaisseaux pendant 30 min. Des bouchons de gel matriciel sont collectés et intégrés dans du gel d’enrobage tissulaire, puis des sections de 12 μm sont découpées pour la détection par fluorescence sans coloration. Dans ce test, le dextran-FITC de haut poids moléculaire (~150 000 Da) peut être utilisé pour indiquer les vaisseaux fonctionnels pour détecter leur longueur, tandis que le dextran-FITC de faible poids moléculaire (~4 400 Da) peut être utilisé pour indiquer la perméabilité des néo-vaisseaux. En conclusion, ce protocole peut fournir une méthode fiable et pratique pour l’étude quantitative de l’angiogenèse in vivo.
Introduction
L’angiogenèse, le processus de formation de néo-vaisseaux à partir de vaisseaux préexistants, joue un rôle essentiel dans de nombreux processus physiologiques et pathologiques, tels que le développement embryonnaire, la cicatrisation des plaies, l’athérosclérose, le développement tumoral, etc.1,2,3,4,5. Ce processus dynamique implique plusieurs étapes, dont la dégradation de la matrice, la prolifération des cellules vasculaires, la migration et l’auto-organisation pour former des structures tubulaires et la stabilisation des néo-vaisseaux6. Il a été démontré que la promotion de l’angiogenèse est essentielle dans le traitement de l’infarctus du myocarde, des accidents vasculaires cérébraux et d’autres types de maladies ischémiques7, tandis que l’inhibition de l’angiogenèse a été considérée comme une stratégie prometteuse dans le traitement des cancers8 et des maladies rhumatoïdes9. L’angiogenèse a été considérée comme un principe organisateur de la découverte de médicaments10. Ainsi, la construction d’une méthode fiable et pratique pour évaluer l’étendue de l’angiogenèse est essentielle pour la recherche mécanique ou la découverte de médicaments dans les maladies dépendantes de l’angiogenèse.
Plusieurs modèles in vitro et in vivo ont été développés pour évaluer l’angiogenèse11. Parmi ceux-ci, les modèles bidimensionnels (2D), comme le test de formation de tubes de gelmatriciel 12, ne peuvent pas former de structures tubulaires fonctionnelles. Les modèles animaux, tels que le modèle d’ischémie des membres postérieurs13,14, peuvent reproduire le processus d’angiogenèse mais sont complexes et nécessitent un système d’imagerie du flux sanguin par chatoiement laser. Les modèles 3D de morphogenèse vasculaire, comme le test du bouchon de gel matriciel, fournissent une plate-forme simple qui peut imiter le processus d’angiogenèse in vivo15, mais la détection de l’angiogenèse nécessite une immunohistochimie ou une coloration par immunofluorescence 16,17,18, qui sont variables et mal visualisées.
Ici, nous décrivons un protocole pour un test de bouchon de gel matriciel modifié où les cellules vasculaires ont été mélangées à du gel matriciel et injectées par voie sous-cutanée dans le dos de souris pour former un bouchon. Dans le bouchon, les cellules vasculaires doivent dégrader la matrice, proliférer, migrer et s’auto-organiser pour finalement former des vaisseaux fonctionnels avec un flux sanguin dans l’environnement interne. Par la suite, du dextran fluorescent est injecté par la veine de la queue, pour s’écouler à travers le bouchon, et l’étiquette est visualisée pour indiquer les néo-vaisseaux. Le contenu de l’angiogenèse peut être évalué quantitativement par la longueur des vaisseaux. Cette méthode peut former des vaisseaux fonctionnels qui ne peuvent pas être produits dans les modèles d’angiogenèse 2D12, et ne nécessite pas de processus de coloration complexe comme dans le test ordinaire de bouchon de gelmatriciel 11. Il ne nécessite pas non plus d’instruments spécifiques coûteux comme le système d’imagerie du flux sanguin par chatoiement laser dans l’ischémie des membres postérieurs modèle 13,14,19. Cette méthode est polyvalente, peu coûteuse, quantifiable et facile à réaliser, et peut être utilisée pour déterminer la capacité pro- ou anti-angiogénique des médicaments ou être utilisée dans la recherche mécanique impliquée dans l’angiogenèse.
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Protocol
Toutes les procédures impliquant des sujets animaux ont été approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université médicale de Wenzhou (XMSQ2021-0057, 19juillet 2021). Tous les réactifs et consommables sont répertoriés dans la table des matériaux.
1. Préparation du milieu de culture
- 10 milieux de culture M199 : Dissoudre la poudre M199 à une concentration 10x avec 90 mL d’eau désionisée et ajouter 10 mL de sérum fœtal bovin (FBS), puis passer à travers un filtre de 0,22 μm. Conservez le milieu à 4 °C jusqu’à 2 mois.
- Milieu de culture endothélial complet : Ajouter 50 mL de FBS, 5 mL de pénicilline/streptomycine et 5 mL de supplément de croissance des cellules endothéliales à 460 mL de milieu de cellules endothéliales (MEC). Conservez le milieu à 4 °C jusqu’à 1 mois.
2. Préparation des cellules vasculaires
- Cultiver 1 x 105 cellules vasculaires (cellules progénitrices endothéliales primairescultivées 14, cellules endothéliales ou lignées cellulaires endothéliales) avec 8 mL de milieu de culture endothélial complet dans une boîte de culture tissulaire de 100 mm à 37 °C et 5 % de CO2 à 70 % de confluence.
- Retirez le milieu de culture et rincez la boîte 2 fois avec 1 solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pour éliminer les cellules non attachées et les débris. Retirer le PBS et ajouter 3 mL de trypsine à 0,25 % contenant 2,21 mM d’EDTA, et incuber à 37 °C pendant 1 min.
- Neutraliser la trypsine avec 7 ml de milieu de culture endothélial complet et rincer délicatement les cellules de la boîte de culture. Confirmez le décollement cellulaire au microscope optique (grossissement de 40x).
- Prélever la suspension cellulaire dans un tube de 15 mL et centrifuger à 400 x g pendant 10 min. Retirer les cellules surnageantes et remettre en suspension les cellules avec 5 mL de milieu de culture endothélial complet.
- Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et déplacer la suspension contenant 2 x 106 cellules dans un tube stérile de 1,5 ml. Chaque bouchon contient 1,5 x 106 cellules, 25% de cellules supplémentaires sont utilisées en cas de gaspillage. Chaque groupe comprend au moins 3 prises.
NOTE : Après des essais, il a été constaté que 1,5 x 106 cellules dans 300 μL de gel matriciel conduisaient au développement correct de l’angiogenèse et ont donc été choisies pour l’expérimentation. - Centrifuger la suspension cellulaire à 400 x g pendant 5 min pour granuler les cellules, puis éliminer le surnageant.
3. Préparation du gel matriciel
- Pré-refroidir des tubes stériles de 1,5 mL contenant des pastilles de cellules dans un bain-marie à 4 °C. Pré-refroidir les seringues à insuline de 30 G et 1 mL dans un réfrigérateur à 4 °C.
- Décongeler complètement le gel matriciel au bain-marie à 4 °C. Ne pas mélanger ou vortex. Pré-refroidissez 10x M199 et testez le réactif/médicament d’intérêt dans un bain-marie à 4 °C.
- Mélanger un gel matriciel pré-refroidi avec 10x M199 contenant 10% de FBS et le réactif à tester à un rapport volumique de 8,8:1:0,2 pour obtenir un gel matriciel et un mélange M199 contenant 1% de FBS et le réactif.
- Remettre en suspension les cellules avec 400 μL du mélange de gel matriciel, mélanger doucement pour éviter la formation de bulles. Gardez le tube sur de la glace jusqu’à ce que les souris soient prêtes pour l’injection. Gardez le mélange de gel matriciel sur de la glace tout le temps pour éviter la coagulation.
REMARQUE : Ici, 300 μL de mélange de gel matriciel contenant 1,5 x 106 cellules ont été utilisés pour former un bouchon de gel. Préparez 25 % de gel supplémentaire selon 25 % de cellules supplémentaires à l’étape 2.
4. Préparation de la souris
- Anesthésier une souris Nu/Nu mâle de 6 à 8 semaines (18 à 25 g) dans la chambre de l’appareil d’anesthésie animale avec de l’isoflurane (3 % d’isoflurane dans 100 % d’oxygène à un débit de 1 L/min). Après une anesthésie réussie, confirmée par l’absence de réflexe de redressement et de réflexe de pincement des orteils, sortir la souris de la chambre, sortir la souris de la chambre et mettre un masque d’anesthésie sur la souris et modifier la concentration d’isoflurane à 1,5 % dans 100 % d’oxygène à un débit de 1 L/min.
REMARQUE : Fournir un soutien thermique à l’animal à l’aide d’un coussin chauffant tout au long de la procédure. - Utilisez une pommade vétérinaire sur les yeux pour prévenir la sécheresse. Collez les membres des souris sur le tableau d’opération en position couchée.
5. Injection de mélange de gel matriciel
- Chargez 300 μL du mélange de gel matriciel dans une seringue à insuline de 1 mL avec une aiguille de 30 G. Évitez la formation de bulles. Chargez rapidement le gel matriciel (dans les 2 minutes) pour éviter la solidification pendant ce temps. Placez immédiatement la seringue à insuline chargée de gel matriciel sur de la glace.
- Nettoyez la peau du dos des souris à l’aide de tampons d’alcool à 75 %. Injecter par voie sous-cutanée 300 μL de mélange de gel matriciel dans un côté du dos des souris.
- Retirez délicatement l’aiguille du site d’injection pour éviter toute fuite du mélange de gel matriciel. Vérifiez s’il y a une petite bosse au site d’injection (figure 1).
- Placez la souris sur le coussin chauffant pendant 2 min pour laisser le mélange de gel matriciel coaguler et former un bouchon.
- Répétez les étapes 5.2. à 5.4. pour créer une prise de l’autre côté de l’arrière de la souris. Marquez les bords des bosses à l’aide d’un marqueur.
- Observez la souris jusqu’à ce qu’elle ait repris suffisamment conscience pour maintenir le décubitus sternal. Mettez la souris dans une cage séparée jusqu’à ce qu’elle soit complètement récupérée. Hébergez les souris dans un laboratoire d’animaux de laboratoire de classe SPF à 22 ± 2 °C avec un cycle lumière/obscurité de 12 heures pendant 7 jours.
6. Injection de Dextran-FITC par la veine de la queue
- Après 7 jours d’injection de gel matriciel, remettre en suspension 0,5 mg de dextran-FITC avec 500 μL d’eau doublement distillée (ddH2O) puis agiter violemment pour obtenir la solution de dextran-FITC à la concentration finale de 1 μg/μL.
REMARQUE : Utilisez le dextran-FITC avec une masse moléculaire de ~150 kDa pour le test d’angiogenèse, et utilisez le dextran-FITC avec une masse moléculaire de ~4 kDa pour le test de perméabilité vasculaire. - Chargez 50 μL de solution de dextran-FITC dans les seringues 29G.
- Fixez la souris sur l’instrument d’injection de la veine caudale. Nettoyez la queue avec une boule de coton à 75 % d’alcool et injectez doucement 50 μL de dextran-FITC par la veine de la queue.
- Comprimez le site d’injection avec un coton-tige pendant 1 min pour arrêter le saignement, puis remettez les souris dans la cage pendant 30 min.
- Répétez les étapes 6.3. et 6.4. jusqu’à ce que toutes les souris aient reçu une injection de dextran-FITC.
7. Collection de bouchons de gel matriciels
- Injecter par voie intrapéritonéale 1 % de pentobarbital sodique dans du PBS (200 mg/kg de poids corporel) et euthanasier les souris selon une procédure approuvée par l’IACUC.
- Coupez la peau le long du bord marqué du bouchon à l’aide de ciseaux chirurgicaux et retirez la peau au-dessus du bouchon de gel matriciel.
- Récupérez le bouchon et rincez-le dans un petit bécher avec 1x PBS pour éliminer l’excès de sang (Figure 2A). La couleur du bouchon peut délimiter approximativement le degré d’abondance du sang et le contenu des néo-vaisseaux (Figure 3A).
8. Enrobage de la matrice de la fiche de gel et préparation de la section
- Couvrez le bouton de la cassette d’enrobage tissulaire avec environ 0,5 mL de gel d’enrobage tissulaire, puis placez immédiatement le bouchon de gel matriciel sur le gel d’enrobage tissulaire dans l’orientation souhaitée, comme indiqué à la figure 2B. Ensuite, intégrez le bouchon avec du gel d’enrobage de tissu supplémentaire.
- Mettez les cassettes au congélateur à -80 °C pendant 12 h pour qu’elles se solidifient.
- Pour la préparation de coupes épaisses, retirez le bloc de bouchon solidifié et coupez des sections de 12 μm d’épaisseur à l’aide du microtome de congélation selon les instructions, puis montez sur des lames de microscope.
- Coupez 5 à 10 sections de chaque bloc de bouchons.
9. Quantification de l’angiogenèse (Figure 3)
- Acquérir des images de fluorescence à partir de 5 champs indépendants de la coupe avec un microscope à fluorescence inversée à une longueur d’onde de 488 nm sous un grossissement de 10x.
- Ouvrez le fichier image avec le logiciel Image J (https://imagej.en.softonic.com/) et cliquez sur le bouton Analyser l’angiogenèse . Ensuite, cliquez sur le bouton Analyser le contraste de phase HUVEC et passez au tableau des résultats des statistiques pour recueillir des informations. Mesurez les 5 images de fluorescence acquises pour chaque section.
- Analyser la longueur totale des néo-vaisseaux de différents groupes pour évaluer statistiquement la différence d’angiogenèse entre ces groupes.
NOTA : La longueur totale des segments maîtres indique la longueur totale des néo-navires. Le réactif qui augmente la longueur des néo-vaisseaux est appelé pro-angiogénique, tandis que le réactif qui diminue la longueur des néo-vaisseaux est anti-angiogénique.
10. Quantification de la perméabilité vasculaire (Figure 4)
- Acquérir des images de fluorescence à partir de 5 champs indépendants de la coupe avec un microscope à fluorescence inversée à une longueur d’onde de 488 nm sous un grossissement de 20x.
- Ouvrez le fichier image avec le logiciel Image J. Cliquez sur le bouton Sélection à main levée et encerclez la zone de fuite, puis cliquez sur le menu Analyser et sélectionnez l’option Mesurer pour obtenir les informations sur la zone de fuite. Utilisez le rapport entre la zone de fuite et la zone de l’image pour indiquer la perméabilité vasculaire.
- Analyser le rapport entre la zone de fuite et la surface de l’image de différents groupes pour évaluer statistiquement la différence de perméabilité vasculaire entre ces groupes.
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Representative Results
La figure 1 est l’organigramme illustrant comment préparer le mélange de gel matriciel, de cellules vasculaires, de milieu de culture et de réactif. Le mélange a ensuite été injecté par voie sous-cutanée dans le dos de souris Nu/Nu et chauffé à l’aide d’un coussin chauffant pour accélérer sa coagulation et finalement former un bouchon de gel.
La figure 2A est l’organigramme permettant d’indiquer les récipients contenant du dextrane marqué fluorescent. Du dextran marqué fluorescent a été injecté via la veine de la queue et le cercle pendant 30 minutes, afin qu’il puisse pénétrer dans le vaisseau fonctionnel du bouchon de gel. Par la suite, les bouchons de gel ont été collectés, incorporés à l’aide d’un gel d’enrobage tissulaire (l’orientation du gel matriciel lorsqu’il est intégré a été indiquée à la figure 2B). Une section de 12 μm d’épaisseur a été découpée dans les bouchons (5 tranches de chaque côté) et des images fluorescentes ont été prises pour une analyse quantitative de l’angiogenèse et/ou de la perméabilité vasculaire.
La figure 3 est l’influence du palmitate de réactif anti-angiogénique et du facteur de croissance des fibroblastes du réactif pro-angiogénique 1 (FGF1) sur l’angiogenèse dans le bouchon de gel. La figure 3A est l’apparence des bouchons de gel avec véhicule, palmitate ou FGF1. Le sang peut pénétrer dans le néo-vaisseau fonctionnel du bouchon de gel, ce qui rend le bouchon rouge à des degrés divers. La figure 3B est l’image fluorescente de bouchons de gel matriciels, dans laquelle les vaisseaux fonctionnels ont été visualisés par dextran-FITC avec une masse moléculaire élevée. La figure 3C est le résultat quantitatif de la longueur des navires de différents groupes. Le palmitate peut diminuer considérablement la longueur des néo-vaisseaux, tandis que le traitement FGF1 peut évidemment augmenter la longueur.
La figure 4 compare la perméabilité vasculaire des bouchons de gel avec ou sans traitement par facteur de croissance de l’endothélium vasculaire (VEGF). La figure 4A est l’image fluorescente de bouchons de gel matriciel, dans laquelle la zone de fuite est visualisée par du dextran-FITC de faible poids moléculaire et indiquée par des flèches. La figure 4B est le résultat quantitatif de la surface de fuite. L’augmentation de la surface de fuite dans le groupe de traitement VEGF a révélé que le VEGF peut augmenter la perméabilité vasculaire.
Graphique 1. Organigramme montrant la formation d’un bouchon de gel chez la souris. Les cellules vasculaires cultivées en culture monocouche sont dissociées, granulées, remises en suspension avec un milieu de cellules endothéliales (ECM) et comptées (I-IV). Après granulation et remise en suspension dans un mélange de gel matriciel (contenant 8,8 volumes de gel matriciel, 1 volume 10x M199 complété par 10 % de FBS et 0,2 volume de réactif), 300 μL de mélange de gel ont été injectés par voie sous-cutanée dans le dos des souris (V-VII) pour former des bouchons. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Graphique 2. Organigramme montrant l’injection de dextran-FITC et la quantification de l’angiogenèse. (A) Le dextran-FITC a été injecté par la veine de la queue (I). Après 30 min, un bouchon de gel a été acquis, nobsté et des sections ont été tranchées à l’aide d’un microtome de congélation (II, III). Par la suite, des images de fluorescence ont été prises à l’aide d’un microscope à fluorescence (IV) et l’angiogenèse a été analysée quantitativement à l’aide du logiciel Image J (V). (B) Le schéma de l’orientation du bouchon de gel matriciel lorsqu’il est intégré dans une cassette d’enrobage tissulaire. Abréviations : OCT = composé à température de coupe optimale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Graphique 3. Évaluation de l’angiogenèse à l’aide d’un test de bouchon de gel matriciel modifié. (A) Apparence de bouchons de gel matriciels représentatifs. (B) L’image fluorescente des vaisseaux fonctionnels dans les bouchons de gel matriciels indiquée par Dextran-FITC. (C) L’analyse quantitative de la longueur des vaisseaux fonctionnels dans les bouchons de gel matriciels à l’aide de l’ANOVA à un facteur. *p<0,05 par rapport au véhicule ; p<0,001 par rapport au véhicule. La barre d’échelle est de 100 μm. Abréviations : FGF1 = Facteur de croissance des fibroblastes 1. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Graphique 4. Évaluation de la perméabilité vasculaire à l’aide d’un test de bouchon de gel matriciel modifié. (A) L’image de fluorescence représentative des récipients dans le bouchon de gel, les flèches indiquent le site de fuite. (B) L’analyse quantitative de la zone de fuite pour évaluer la perméabilité vasculaire à l’aide du test t de Student. p<0.001. La barre d’échelle est de 100 μm. Abréviations : VEGF = facteur de croissance de l’endothélium vasculaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Nous présentons une méthode fiable et pratique pour l’évaluation quantitative de l’angiogenèse in vivo sans coloration. Dans ce protocole, les cellules vasculaires ont été mélangées à du gel matriciel en présence de réactifs pro-angiogéniques ou anti-angiogéniques, puis injectées par voie sous-cutanée dans le dos de souris Nu/Nu pour former un bouchon de gel (Figure 1). Après 7 jours de formation d’un bouchon de gel, le dextran-FITC a été injecté par voie intraveineuse et a circulé pendant 30 minutes. Le bouchon de gel a été prélevé et intégré dans du gel d’enrobage tissulaire, et des sections de 12 μm ont été coupées pour la photographie (figure 2). Le dextran-FITC peut indiquer des vaisseaux fonctionnels sans coloration, et la longueur des néo-vaisseaux peut être utilisée pour évaluer quantitativement la fonction pro-angiogénique ou anti-angiogénique des réactifs. Dans l’exemple présenté dans ce protocole, le traitement au palmitate a réduit la longueur des néo-vaisseaux, tandis que FGF1 a augmenté la longueur des néo-vaisseaux (Figure 3), ce qui indique que le palmitate est anti-angiogénique, tandis que FGF1 est pro-angiogénique. En outre, ce protocole peut également être utilisé dans l’évaluation de la perméabilité vasculaire (Figure 4).
Il faut faire preuve de prudence lors de la sélection des souris receveuses, de la manipulation et de l’injection du gel matriciel, de la collecte du bouchon de gel et de la détection de la longueur des vaisseaux. Les souris immunodéficientes âgées de 6 à 8 semaines sont recommandées, bien que les souris C57BL/6 soient également utilisables. Compte tenu de la variabilité de la prise, il est recommandé d’utiliser 3 à 5 fiches dans chaque groupe. Le nombre de cellules vasculaires doit être égal entre les différents groupes. Le gel matriciel doit être manipulé avec précaution conformément aux instructions et ne doit pas être utilisé s’il est solidifié ou contient des particules ou de nombreuses bulles. Dans l’étape de préparation du gel matriciel, la concentration finale de gel matriciel ne doit pas être inférieure à 80 %, et le vortex n’est pas autorisé car des bulles peuvent se former. Il convient de noter que la forme du bouchon de gel peut influencer la reproductibilité des résultats, c’est pourquoi un coussin chauffant a été utilisé pour accélérer la solidification du bouchon de gel matriciel. Un incubateur pour animaux à 37 °C peut également être utilisé. En outre, lors de l’enrobage des bouchons de gel et de la préparation des coupes, les bouchons et les coupes doivent être protégés contre la lumière vive, et les photos doivent être prises au microscope à fluorescence dès que possible.
Parmi les différents tests d’angiogenèse in vivo , le test du bouchon de gel matriciel est l’une des méthodes les plus utilisées car il est polyvalent, moins coûteux et facile à réaliser11. Cependant, le processus de coloration dans le test ordinaire du bouchon de gel matriciel est sujet aux erreurs. Le bouchon est fragile et à forte teneur en eau. Les étapes de déshydratation et de fixation incluses dans le processus de coloration peuvent déformer le bouchon de gel et influencer davantage l’évaluation de la longueur des vaisseaux. En outre, les cellules vasculaires dispersées dans le bouchon peuvent être colorées et reconnues comme des vaisseaux fonctionnels dans le test ordinaire du bouchon de gel matriciel. L’un des avantages les plus importants de ce test de bouchon de gel matriciel modifié est que les vaisseaux fonctionnels peuvent être visualisés sans coloration. Le dextran marqué FITC a été utilisé pour indiquer les vaisseaux, et seuls les vaisseaux fonctionnels qui ont un flux sanguin peuvent être indiqués, ce qui contribue à la commodité et à la fiabilité de ce test.
Outre la longueur des néo-vaisseaux, la perméabilité affecte également la fonction des néo-vaisseaux20. Le dextran marqué par fluorescence de faible poids moléculaire (~4 400 Da) peut passer à travers l’espace dans les vaisseaux et peut être utilisé pour indiquer la perméabilité des néo-vaisseaux. Si nécessaire, les chercheurs peuvent évaluer à la fois l’angiogenèse et la perméabilité vasculaire dans le même bouchon de gel en utilisant à la fois du dextran marqué fluorescent de faible poids moléculaire et un dextran de haut poids moléculaire21.
L’angiogenèse peut être affectée par l’environnement in vivo 22, comme le diabète 13,14,19, etc. Cet environnement in vivo est difficile à reproduire dans ces modèles in vitro. Cependant, dans ce protocole modifié, l’environnement in vivo peut être facilement reproduit en choisissant des souris receveuses appropriées. En outre, l’interaction entre différentes cellules vasculaires affecte également le processus d’angiogenèse. Différents types de cellules vasculaires, y compris les cellules endothéliales, les cellules musculaires lisses et les péricytes, peuvent être ajoutés pour former des néo-vaisseaux dans le bouchon de ce protocole afin d’étudier la contribution de différentes cellules vasculaires dans l’angiogenèse.
Cependant, il existe également certaines limites pour cette méthode. La formation de néo-vaisseaux peut être affectée par la forme du bouchon de gel. De plus, les néo-vaisseaux formés dans le bouchon de gel ne sont pas réguliers. Il y a plus de vaisseaux fonctionnels au bord du bouchon de gel qu’au centre (Figure 2A). Ainsi, les résultats peuvent être affectés par la compétence de l’interprète.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Ce travail a été financé par la Fondation des sciences naturelles de la province du Zhejiang (LY22H020005) et la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (81873466).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adhesion Microscope Slides | CITOTEST | 188105 | |
| Anesthesia System | RWD | R640-S1 | |
| Cell Counter | Invitrogen | AMQAX1000 | |
| Cell Culture Dish | Corning | 430167 | |
| Cryoslicer | Thermo Fisher | CryoStar NX50 | |
| Dextrans-FITC-150kDa | WEIHUA BIO | WH007N07 | |
| Dextrans-FITC-4kDa | WEIHUA BIO | WH007N0705 | |
| Embedding Cassettes | CITOTEST | 80203-0007 | |
| Endothelial Cell Medium | ScienCell | 35809 | |
| Endothelial Growth Supplements | ScienCell | 1025 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10100147C | |
| Fibroblast Growth Factor 1 | AtaGenix | 9043p-082318-A01 | FGF1 |
| Fluorescence Microscope | Nikon | ECLIPSE Ni | |
| Heating Pad | Boruida | 30-50-30 | |
| Insulin Syringe | BD | 300841 | |
| Isoflurane | RWD | R510-22-10 | |
| Laboratory Balance | Sartorius | BSA124S-CW | |
| Matrigel | Corning | 356234 | Matrix gel |
| Medium 199 powder | Gibco | 31100-035 | |
| Microtubes | Axygen | MCT-150-C | |
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound | SUKURA | 4583 | Tissue embedding gel |
| Palmitate Acid | KunChuang | KC001 | |
| Penicillin-Streptomycin Liquid | Solarbio | P1400 | |
| Phosphate Buffer Saline | Solarbio | P1022 | |
| Surgical Instruments | RWD | RWD | |
| Tail Vein Injection Instrument | KEW BASIS | KW-XXY | |
| Trypsin-EDTA Solution | Solarbio | T1320 | |
| Ultra-Low Temperature Freezer | eppendorf | U410 | |
| Vascular Endothelial Growth Factor | CHAMOT | CM058-5HP | VEGF |
References
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