Summary
Die hier vorgestellte Methode kann die Wirkung von Reagenzien auf die Angiogenese oder die Gefäßpermeabilität in vivo ohne Färbung bewerten. Die Methode verwendet die Dextran-FITC-Injektion über die Schwanzvene, um Neogefäße oder Gefäßleckagen sichtbar zu machen.
Abstract
Es wurden mehrere Modelle entwickelt, um die Angiogenese in vivo zu untersuchen. Die meisten dieser Modelle sind jedoch komplex und teuer, erfordern spezielle Geräte oder sind für die anschließende quantitative Analyse schwer durchzuführen. Hier präsentieren wir einen modifizierten Matrix-Gel-Plug-Assay zur Bewertung der Angiogenese in vivo. In diesem Protokoll wurden Gefäßzellen in Gegenwart oder Abwesenheit von pro-angiogenen oder anti-angiogenen Reagenzien mit Matrixgel gemischt und dann subkutan in den Rücken der Empfängermäuse injiziert. Nach 7 Tagen wird Phosphatpuffer-Kochsalzlösung, die Dextran-FITC enthält, über die Schwanzvene injiziert und 30 Minuten lang in den Gefäßen zirkuliert. Matrix-Gel-Plugs werden gesammelt und mit Gewebeeinbettungsgel eingebettet, dann werden 12-μm-Abschnitte für die Fluoreszenzdetektion ohne Färbung geschnitten. In diesem Assay kann Dextran-FITC mit hohem Molekulargewicht (~150.000 Da) verwendet werden, um funktionelle Gefäße zum Nachweis ihrer Länge anzuzeigen, während Dextran-FITC mit niedrigem Molekulargewicht (~4.400 Da) verwendet werden kann, um die Permeabilität von Neogefäßen anzuzeigen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses Protokoll eine zuverlässige und bequeme Methode für die quantitative Untersuchung der Angiogenese in vivo bieten kann.
Introduction
Die Angiogenese, der Prozess der Bildung von Neogefäßen aus bereits bestehenden Gefäßen, spielt eine entscheidende Rolle bei vielen physiologischen und pathologischen Prozessen wie Embryonalentwicklung, Wundheilung, Arteriosklerose, Tumorentwicklung usw.1,2,3,4,5. Dieser dynamische Prozess umfasst mehrere Schritte, darunter den Abbau der Matrix, die Proliferation von Gefäßzellen, die Migration und Selbstorganisation zu röhrenförmigen Strukturen sowie die Stabilisierung der Neogefäße6. Die Förderung der Angiogenese hat sich bei der Behandlung von Myokardinfarkt, Schlaganfall und anderen Arten von ischämischen Erkrankungen als entscheidend erwiesen7, während die Hemmung der Angiogenese als vielversprechende Strategie bei der Behandlung von Krebs8 und rheumatoiden Erkrankungen9 angesehen wurde. Die Angiogenese wurde als Organisationsprinzip für die Arzneimittelforschung angesehen10. Daher ist die Konstruktion einer zuverlässigen und bequemen Methode zur Beurteilung des Ausmaßes der Angiogenese für die mechanische Forschung oder die Arzneimittelforschung bei Angiogenese-abhängigen Erkrankungen von entscheidender Bedeutung.
Es wurden mehrere In-vitro- und In-vivo-Modelle entwickelt, um die Angiogenesezu bewerten 11. Unter diesen können zweidimensionale (2-D) Modelle, wie der Matrix-Gel-Röhrchenbildungsassay12, keine funktionellen röhrenförmigen Strukturen bilden. Die Tiermodelle, wie z. B. das Ischämie-Modellder Hintergliedmaßen 13,14, können den Angiogeneseprozess reproduzieren, sind jedoch komplex und erfordern ein Laser-Speckle-Blutfluss-Bildgebungssystem. 3D-Modelle der vaskulären Morphogenese, wie der Matrix-Gel-Plug-Assay, bieten eine einfache Plattform, die den Prozess der Angiogenese in vivo nachahmen kann 15, aber der Nachweis der Angiogenese erfordert Immunhistochemie oder Immunfluoreszenzfärbung 16,17,18, die variabel und schlecht visualisiert sind.
Hier beschreiben wir ein Protokoll für einen modifizierten Matrix-Gel-Plug-Assay, bei dem Gefäßzellen mit Matrixgel gemischt und subkutan in den Rücken von Mäusen injiziert wurden, um einen Plug zu bilden. Im Pfropfen müssen Gefäßzellen die Matrix abbauen, sich vermehren, migrieren und sich selbst organisieren, um schließlich funktionsfähige Gefäße mit Blutfluss in der inneren Umgebung zu bilden. Danach wird fluoreszenzmarkiertes Dextran über die Schwanzvene injiziert, um durch den Pfropfen zu fließen, und die Markierung wird visualisiert, um Neogefäße anzuzeigen. Der Gehalt an Angiogenese kann quantitativ anhand der Länge der Gefäße bewertet werden. Diese Methode kann funktionelle Gefäße bilden, die in 2-D-Angiogenesemodellen12 nicht hergestellt werden können, und erfordert keinen komplexen Färbeprozess wie bei gewöhnlichem Matrix-Gel-Plug-Assay11. Es erfordert auch keine teuren spezifischen Instrumente wie das Laser-Speckle-Blutfluss-Bildgebungssystem bei der Ischämie der HintergliedmaßenModell 13,14,19. Diese Methode ist vielseitig, kostengünstig, quantifizierbar und einfach durchzuführen und kann zur Bestimmung der pro- oder antiangiogenen Fähigkeit von Arzneimitteln oder in der mechanischen Forschung zur Angiogenese verwendet werden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle Verfahren mit tierischen Probanden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Wenzhou Medical University genehmigt (XMSQ2021-0057, 19. Juli 2021). Alle Reagenzien und Verbrauchsmaterialien sind in der Materialtabelle aufgeführt.
1. Vorbereitung des Nährmediums
- 10x M199-Nährmedium: M199-Pulver mit 90 ml deionisiertem Wasser auf 10-fache Konzentration auflösen und 10 ml fötales Kälberserum (FBS) hinzufügen, dann durch einen 0,22-μm-Filter passieren. Lagern Sie das Medium bis zu 2 Monate bei 4 °C.
- Vollständiges Endothelkulturmedium: Fügen Sie 50 ml FBS, 5 ml Penicillin/Streptomycin und 5 ml Endothelzellwachstumsergänzung zu 460 ml Endothelzellmedium (ECM) hinzu. Lagern Sie das Medium bis zu 1 Monat bei 4 °C.
2. Vorbereitung der Gefäßzellen
- Kultivierung von 1 x 105 Gefäßzellen (primär kultivierte endotheliale Vorläuferzellen14, Endothelzellen oder Endothelzelllinien) mit 8 ml vollständigem Endothelkulturmedium in einer 100-mm-Gewebekulturschale bei 37 °C und 5 % CO2 bis 70 % Konfluenz.
- Entfernen Sie das Kulturmedium und spülen Sie die Schale 2x mit 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) aus, um nicht anhaftende Zellen und Ablagerungen zu entfernen. Entfernen Sie PBS und fügen Sie 3 ml 0,25% Trypsin mit 2,21 mM EDTA hinzu und inkubieren Sie es 1 Minute lang bei 37 °C.
- Neutralisieren Sie das Trypsin mit 7 ml vollständigem endothelialem Kulturmedium und spülen Sie die Zellen vorsichtig von der Kulturschale ab. Bestätigen Sie die Zellablösung unter einem Lichtmikroskop (40-fache Vergrößerung).
- Zellsuspension in einem 15-ml-Röhrchen sammeln und 10 Minuten bei 400 x g zentrifugieren. Überstand entfernen und Zellen mit 5 ml vollständigem endothelialem Kulturmedium resuspendieren.
- Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und geben Sie die Suspension mit 2 x 106 Zellen in ein steriles 1,5-ml-Röhrchen. Jeder Stopfen enthält 1,5 x 106 Zellen, zusätzliche 25% Zellen werden im Falle von Abfall verwendet. Jede Gruppe enthält mindestens 3 Stecker.
HINWEIS: Nach Versuchen wurde festgestellt, dass 1,5 x 106 Zellen in 300 μl Matrixgel zur ordnungsgemäßen Entwicklung der Angiogenese führten, und wurde daher für Experimente ausgewählt. - Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 400 x g für 5 Minuten, um die Zellen zu pelletieren, und entfernen Sie dann den Überstand.
3. Matrix-Gel-Vorbereitung
- Sterile 1,5-ml-Röhrchen mit Zellpellets in einem 4 °C-Wasserbad vorkühlen. 30 g 1 ml Insulinspritzen in einem 4 °C-Kühlschrank vorkühlen.
- Matrix-Gel in einem 4 °C warmen Wasserbad vollständig auftauen. Nicht mischen oder wirbeln. 10x M199 vorkühlen und Reagenz/Drug-of-Interest in einem 4 °C warmen Wasserbad testen.
- Mischen Sie vorgekühltes Matrixgel mit 10x M199 mit 10% FBS und dem zu testenden Reagenz bei einem Volumenverhältnis von 8,8:1:0,2, um ein Matrixgel und eine M199-Mischung mit 1% FBS und dem Reagenz zu erhalten.
- Resuspendieren Sie die Zellen mit 400 μl der Matrixgelmischung und mischen Sie sie vorsichtig, um Blasenbildung zu vermeiden. Halten Sie das Röhrchen auf Eis, bis die Mäuse für die Injektion vorbereitet sind. Halten Sie die Matrix-Gel-Mischung die ganze Zeit auf Eis, um eine Gerinnung zu vermeiden.
HINWEIS: Hier wurden 300 μl Matrixgelmischung mit 1,5 x 106 Zellen verwendet, um einen Gelpfropfen zu bilden. Bereiten Sie 25% zusätzliches Gel entsprechend 25% zusätzlichen Zellen in Schritt 2 vor.
4. Vorbereitung der Maus
- Betäuben Sie 6-8 Wochen alte männliche Nu/Nu-Maus (18-25 g) in der Kammer des Tieranästhesiegeräts mit Isofluran (3% Isofluran in 100% Sauerstoff bei einer Durchflussrate von 1 l/min). Nach erfolgreicher Anästhesie, bestätigt durch das Fehlen von Aufrichtreflex und Zehenklemmreflex, bewegen Sie die Maus aus der Kammer, bewegen Sie die Maus aus der Kammer und setzen Sie eine Anästhesiemaske auf die Maus und ändern Sie die Isoflurankonzentration auf 1,5% in 100% Sauerstoff bei einer Durchflussrate von 1 l/min.
HINWEIS: Bieten Sie dem Tier während des gesamten Vorgangs thermische Unterstützung mit einem Heizkissen. - Verwenden Sie Tierarztsalbe auf den Augen, um Trockenheit zu vermeiden. Kleben Sie die Gliedmaßen der Mäuse in Bauchlage auf die Operationsplatine.
5. Injektion von Matrix-Gel-Gemischen
- Laden Sie 300 μl der Matrixgelmischung in eine 1 ml Insulinspritze mit einer 30G-Nadel. Vermeiden Sie Blasenbildung. Laden Sie das Matrixgel schnell (innerhalb von 2 Minuten), um eine Verfestigung während dieser Zeit zu vermeiden. Legen Sie die mit Matrixgel beladene Insulinspritze sofort auf Eis.
- Reinigen Sie die Haut auf dem Rücken von Mäusen mit 75%igen Alkoholpads. Injizieren Sie subkutan 300 μl Matrixgelmischung in eine Seite des Rückens von Mäusen.
- Entfernen Sie die Nadel vorsichtig von der Injektionsstelle, um ein Auslaufen der Matrixgelmischung zu verhindern. Achten Sie auf einen kleinen Buckel an der Injektionsstelle (Abbildung 1).
- Legen Sie die Maus 2 Minuten lang auf das Heizkissen, damit die Matrix-Gel-Mischung gerinnen und einen Stopfen bilden kann.
- Wiederholen Sie die Schritte 5.2. bis 5.4. , um einen Stecker auf der anderen Seite der Rückseite der Maus zu erstellen. Markieren Sie die Kanten der Höcker mit einem Filzstift.
- Beobachten Sie die Maus, bis sie wieder genügend Bewusstsein erlangt hat, um die Brustbeinlage aufrechtzuerhalten. Legen Sie die Maus in einen separaten Käfig, bis sie vollständig wiederhergestellt ist. Halten Sie die Mäuse im Versuchstierlabor der SPF-Klasse bei 22 ± 2 °C mit einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus für 7 Tage.
6. Dextran-FITC-Injektion durch die Schwanzvene
- Nach 7 Tagen Matrixgel-Injektion werden 0,5 mg Dextran-FITC mit 500 μl doppelt destilliertem Wasser (ddH2O) resuspendiert und dann heftig vortexen, um die Dextran-FITC-Lösung mit der Endkonzentration von 1 μg/μl zu erhalten.
HINWEIS: Verwenden Sie Dextran-FITC mit einem Molekulargewicht von ~150 kDa für den Angiogenese-Assay und verwenden Sie Dextran-FITC mit einem Molekulargewicht von ~4 kDa für den Gefäßpermeabilitätstest. - Laden Sie 50 μl Dextran-FITC-Lösung in die 29G-Spritzen.
- Befestigen Sie die Maus am Schwanzvenen-Injektionsinstrument. Reinigen Sie den Schwanz mit einem Wattebausch mit 75 % Alkohol und injizieren Sie vorsichtig 50 μl Dextran-FITC durch die Schwanzvene.
- Drücken Sie die Injektionsstelle 1 Minute lang mit einem Wattestäbchen zusammen, um die Blutung zu stillen, und setzen Sie die Mäuse dann für 30 Minuten wieder in den Käfig.
- Wiederholen Sie die Schritte 6.3. und 6.4. bis alle Mäuse eine Dextran-FITC-Injektion erhalten haben.
7. Matrix-Gel-Plug-Kollektion
- Intraperitoneal injizieren Sie 1% Pentobarbital-Natrium in PBS (200 mg/kg Körpergewicht) und euthanasieren Sie die Mäuse mit einem von der IACUC zugelassenen Verfahren.
- Schneiden Sie die Haut entlang des markierten Randes des Plugs mit einer chirurgischen Schere ab und entfernen Sie die Haut über dem Matrix-Gel-Plug.
- Sammeln Sie den Stopfen und spülen Sie ihn in einem kleinen Becherglas mit 1x PBS aus, um überschüssiges Blut abzuwaschen (Abbildung 2A). Die Farbe des Pfropfens kann grob den Grad der Bluthäufigkeit und den Inhalt der Neogefäße beschreiben (Abbildung 3A).
8. Einbettung des Matrix-Gel-Plugs und Schnittvorbereitung
- Decken Sie den Knopf der Gewebeeinbettungskassette mit etwa 0,5 ml Gewebeeinbettungsgel ab und setzen Sie dann sofort den Matrix-Gel-Stopfen in der gewünschten Ausrichtung auf das Gewebeeinbettgel, wie in Abbildung 2B gezeigt. Betten Sie dann den Plug mit zusätzlichem Gewebeeinbettungsgel ein.
- Legen Sie die Kassetten für 12 h in einen -80 °C Gefrierschrank, damit sie fest werden.
- Für die Dickschliffpräparation nehmen Sie den erstarrten Pfropfenblock heraus und schneiden Sie mit dem Gefriermikrotom gemäß der Anleitung 12 μm dicke Schnitte und montieren Sie sie auf Objektträger.
- Schneiden Sie 5-10 Abschnitte von jedem Steckblock ab.
9. Quantifizierung der Angiogenese (Abbildung 3)
- Erfassen Sie Fluoreszenzbilder von 5 unabhängigen Feldern des Schnitts mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop bei 488 nm Wellenlänge unter 10-facher Vergrößerung.
- Öffnen Sie die Bilddatei mit der Image J-Software (https://imagej.en.softonic.com/) und klicken Sie auf die Schaltfläche Angiogenese-Analyse . Klicken Sie dann auf die Schaltfläche HUVEC-Phasenkontrast analysieren und wechseln Sie zur Tabelle der Statistikergebnisse , um Informationen zu sammeln. Messen Sie alle 5 aufgenommenen Fluoreszenzbilder für jeden Abschnitt.
- Analysieren Sie die Gesamtlänge der Neogefäße aus verschiedenen Gruppen, um den Unterschied in der Angiogenese zwischen diesen Gruppen statistisch zu bewerten.
HINWEIS: Die Gesamtlänge der Mastersegmente gibt die Gesamtlänge von Neo-Schiffen an. Das Reagenz, das die Länge der Neogefäße erhöht, wird als pro-angiogen bezeichnet, während das Reagenz, das die Länge der Neogefäße verringert, anti-angiogen ist.
10. Quantifizierung der Gefäßpermeabilität (Abbildung 4)
- Erfassen Sie Fluoreszenzbilder aus 5 unabhängigen Feldern des Schnitts mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop bei 488 nm Wellenlänge unter 20-facher Vergrößerung.
- Öffnen Sie die Image-Datei mit der Image J-Software. Klicken Sie auf die Schaltfläche Freihandauswahl und kreisen Sie den Leckagebereich ein, klicken Sie dann auf das Menü Analysieren und wählen Sie die Option Messen , um die Flächeninformationen des Leckagebereichs zu erhalten. Verwenden Sie das Verhältnis von Leckagefläche und Bildbereich, um die Gefäßpermeabilität anzuzeigen.
- Analysieren Sie das Verhältnis von Leckagefläche und Bildfläche aus verschiedenen Gruppen, um den Unterschied in der Gefäßpermeabilität zwischen diesen Gruppen statistisch zu bewerten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Abbildung 1 zeigt das Flussdiagramm, wie die Mischung aus Matrixgel, Gefäßzellen, Kulturmedium und Reagenz hergestellt wird. Die Mischung wurde dann subkutan in den Rücken von Nu/Nu-Mäusen injiziert und mit einem Heizkissen erhitzt, um die Gerinnung zu beschleunigen und schließlich einen Gelpfropfen zu bilden.
Abbildung 2A ist das Flussdiagramm zur Anzeige von Gefäßen mit fluoreszenzmarkiertem Dextran. Fluoreszenzmarkiertes Dextran wurde über die Schwanzvene und den Kreis für 30 Minuten injiziert, damit es in das funktionelle Gefäß im Gelpfropfen gelangen kann. Danach wurden die Gelpfropfen gesammelt und mit Gewebeeinbettungsgel eingebettet (die Orientierung des eingebetteten Matrixgels war in Abbildung 2B angegeben). Ein 12 μm dicker Schnitt wurde von den Pfropfen geschnitten (5 Schichten von jeder Seite) und Fluoreszenzbilder wurden zur quantitativen Analyse der Angiogenese und/oder Gefäßpermeabilität aufgenommen.
Abbildung 3 zeigt den Einfluss von anti-angiogenem Reagenzpalmitat und pro-angiogenem Reagenz Fibroblasten-Wachstumsfaktor 1 (FGF1) auf die Angiogenese im Gelpfropfen. Abbildung 3A zeigt das Aussehen von Gelstopfen mit Fahrzeug, Palmitat oder FGF1. Blut kann in das funktionelle Neogefäß im Gelpfropfen gelangen, wodurch der Pfropfen in unterschiedlichem Maße rot wird. Abbildung 3B ist das Fluoreszenzbild von Matrix-Gel-Pfropfen, in dem die funktionellen Gefäße durch Dextran-FITC mit hohem Molekulargewicht sichtbar gemacht wurden. Abbildung 3C ist das quantitative Ergebnis der Gefäßlänge verschiedener Gruppen. Palmitat kann die Länge von Neogefäßen erheblich verringern, während die FGF1-Behandlung die Länge offensichtlich verlängern kann.
Abbildung 4 vergleicht die Gefäßpermeabilität in Gelpfropfen mit oder ohne Behandlung mit vaskulärem endothelialem Wachstumsfaktor (VEGF). Abbildung 4A ist das Fluoreszenzbild von Matrix-Gel-Pfropfen, in dem der Leckagebereich durch Dextran-FITC mit niedrigem Molekulargewicht visualisiert und durch Pfeile gekennzeichnet ist. Abbildung 4B ist das quantitative Ergebnis der Leckagefläche. Die vergrößerte Leckagefläche in der VEGF-Behandlungsgruppe zeigte, dass VEGF die Gefäßpermeabilität erhöhen kann.
Abbildung 1. Flussdiagramm, das die Bildung eines Gelpfropfens bei Mäusen zeigt. In Monolayer-Kultur kultivierte Gefäßzellen werden dissoziiert, pelletiert, mit Endothelzellmedium (EZM) resuspendiert und gezählt (I-IV). Nach der Pelletierung und Resuspension in einer Matrixgelmischung (mit 8,8 Volumen-Matrixgel, 1 Volumen 10x M199, ergänzt mit 10% FBS und 0,2 Volumenreagenz) wurden 300 μl Gelmischung subkutan in den Rücken der Mäuse (V-VII) injiziert, um Pfropfen zu bilden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2. Flussdiagramm mit Dextran-FITC-Injektion und Quantifizierung der Angiogenese. (A) Dextran-FITC wurde über die Schwanzvene (I) injiziert. Nach 30 min wurde ein Gelpfropfen aufgenommen, eingebettet und Schnitte mit einem Gefriermikrotom (II, III) geschnitten. Danach wurden Fluoreszenzbilder mit dem Fluoreszenzmikroskop (IV) aufgenommen und die Angiogenese mit der Software Image J (V) quantitativ analysiert. (B) Das Diagramm der Ausrichtung des Matrix-Gel-Plugs beim Einbetten in die Gewebeeinbettungskassette. Abkürzungen: OCT = Optimum Cutting Temperatur Compound. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3. Bewertung der Angiogenese mit modifiziertem Matrix-Gel-Plug-Assay. (A) Aussehen repräsentativer Matrix-Gel-Plugs. (B) Das Fluoreszenzbild der funktionellen Gefäße in Matrix-Gel-Pfropfen, angezeigt durch Dextran-FITC. (C) Die quantitative Analyse der Länge funktioneller Gefäße in Matrix-Gel-Plugs unter Verwendung von Einweg-ANOVA. *p<0,05 im Vergleich zum Fahrzeug; p<0,001 im Vergleich zum Fahrzeug. Der Maßstabsbalken beträgt 100 μm. Abkürzungen: FGF1 = Fibroblasten-Wachstumsfaktor 1. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4. Bewertung der Gefäßpermeabilität mit modifiziertem Matrix-Gel-Plug-Assay. (A) Das repräsentative Fluoreszenzbild von Gefäßen im Gelstopfen, die Pfeile zeigen die Leckstelle an. (B) Die quantitative Analyse des Leckagebereichs zur Bewertung der Gefäßpermeabilität mit dem Student's t-Test. p<0,001. Der Maßstabsbalken beträgt 100 μm. Abkürzungen: VEGF = vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Wir präsentieren eine zuverlässige und komfortable Methode zur quantitativen Bewertung der Angiogenese in vivo ohne Färbung. In diesem Protokoll wurden Gefäßzellen in Gegenwart von pro-angiogenen oder anti-angiogenen Reagenzien mit Matrixgel gemischt und dann subkutan in den Rücken von Nu/Nu-Mäusen injiziert, um einen Gelpfropfen zu bilden (Abbildung 1). Nach 7 Tagen Gelpfropfenbildung wurde Dextran-FITC intravenös injiziert und 30 Minuten lang zirkuliert. Der Gelpfropfen wurde gesammelt und mit Gewebeeinbettungsgel eingebettet, und 12 μm-Schnitte wurden für die Fotografie geschnitten (Abbildung 2). Dextran-FITC kann funktionelle Gefäße ohne Färbung anzeigen, und die Länge von Neogefäßen kann verwendet werden, um die pro-angiogene oder anti-angiogene Funktion von Reagenzien quantitativ zu bewerten. In dem in diesem Protokoll vorgestellten Beispiel reduzierte die Palmitatbehandlung die Länge der Neogefäße, während FGF1 die Länge der Neogefäße erhöhte (Abbildung 3), was darauf hindeutet, dass Palmitat antiangiogen ist, während FGF1 pro-angiogen ist. Darüber hinaus kann dieses Protokoll auch zur Bewertung der Gefäßpermeabilität verwendet werden (Abbildung 4).
Vorsicht ist geboten bei der Auswahl der Empfängermäuse, der Handhabung und Injektion des Matrixgels, dem Sammeln des Gelpfropfens und dem Erkennen der Länge der Gefäße. Immundefiziente Mäuse im Alter von 6-8 Wochen werden empfohlen, obwohl auch C57BL/6-Mäuse geeignet sind. In Anbetracht der Variabilität des Steckers werden 3-5 Stecker in jeder Gruppe empfohlen. Die Anzahl der Gefäßzellen sollte zwischen verschiedenen Gruppen gleichmäßig sein. Matrixgel sollte gemäß den Anweisungen sorgfältig behandelt und nicht verwendet werden, wenn es verfestigt ist oder Partikel oder zahlreiche Blasen enthält. Im Schritt der Matrixgelherstellung sollte die Endkonzentration des Matrixgels nicht weniger als 80% betragen, und ein Wirbel ist nicht zulässig, da sich Blasen bilden können. Es ist zu beachten, dass die Form des Gelpfropfens die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse beeinflussen kann, daher wurde ein Heizkissen verwendet, um die Verfestigung des Matrix-Gelpfropfens zu beschleunigen. Ein 37 °C heißer Tierinkubator kann ebenfalls verwendet werden. Außerdem sollten während der Einbettung und Schnittvorbereitung der Gelpfropfen die Pfropfen und Schnitte vor hellem Licht geschützt und die Fotos so schnell wie möglich unter dem Fluoreszenzmikroskop aufgenommen werden.
Unter den verschiedenen In-vivo-Angiogenese-Assays ist der Matrix-Gel-Plug-Assay eine der am weitesten verbreiteten Methoden, da er vielseitig, kostengünstiger und einfach durchzuführen ist11. Der Färbeprozess im gewöhnlichen Matrix-Gel-Plug-Assay ist jedoch fehleranfällig. Der Stopfen ist zerbrechlich und hat einen hohen Wassergehalt. Die im Färbeprozess enthaltenen Dehydratisierungs- und Fixierungsschritte können den Gelpfropfen verzerren und die Beurteilung der Länge der Gefäße weiter beeinflussen. Darüber hinaus können die verstreuten Gefäßzellen im Pfropfen gefärbt und als funktionelle Gefäße in einem gewöhnlichen Matrix-Gel-Pfropfen-Assay erkannt werden. Einer der wichtigsten Vorteile dieses modifizierten Matrix-Gel-Plug-Assays besteht darin, dass die funktionellen Gefäße ohne Färbung sichtbar gemacht werden können. FITC-markiertes Dextran wurde verwendet, um Gefäße anzuzeigen, und nur funktionelle Gefäße mit Blutfluss können angezeigt werden, was zur Bequemlichkeit und Zuverlässigkeit dieses Assays beiträgt.
Neben der Länge der Neogefäße wirkt sich die Durchlässigkeit auch auf die Funktion der Neogefäßeaus 20. Fluoreszenzmarkiertes Dextran mit niedrigem Molekulargewicht (~4.400 Da) kann die Lücke in den Gefäßen passieren und kann verwendet werden, um die Permeabilität von Neogefäßen anzuzeigen. Bei Bedarf können Forscher sowohl die Angiogenese als auch die Gefäßpermeabilität im selben Gelpfropfen bewerten, indem sie sowohl fluoreszenzmarkiertes Dextran mit niedrigem Molekulargewicht als auch dieses mit hohem Molekulargewicht verwenden21.
Die Angiogenese kann durch die In-vivo-Umgebung 22 beeinflusst werden, wie z. B. Diabetes13, 14, 19 usw. Diese In-vivo-Umgebung ist in diesen In-vitro-Modellen schwer zu reproduzieren. In diesem modifizierten Protokoll kann die In-vivo-Umgebung jedoch leicht reproduziert werden, indem die richtigen Empfängermäuse ausgewählt werden. Darüber hinaus beeinflusst die Interaktion zwischen verschiedenen Gefäßzellen auch den Prozess der Angiogenese. Verschiedene Arten von Gefäßzellen, einschließlich Endothelzellen, glatte Muskelzellen und Perizyten, können in diesem Protokoll hinzugefügt werden, um Neogefäße im Plug zu bilden, um den Beitrag verschiedener Gefäßzellen zur Angiogenese zu untersuchen.
Es gibt jedoch auch einige Einschränkungen für diese Methode. Die Bildung von Neogefäßen kann durch die Form des Gelpfropfens beeinflusst werden. Darüber hinaus sind die im Gelpfropfen gebildeten Neogefäße nicht gleichmäßig. Am Rand des Gelpfropfens befinden sich mehr funktionelle Gefäße als in der Mitte (Abbildung 2A). Daher können die Ergebnisse durch die Fähigkeiten des Ausführenden beeinflusst werden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der Natural Science Foundation der Provinz Zhejiang (LY22H020005) und der National Natural Science Foundation of China (81873466) finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adhesion Microscope Slides | CITOTEST | 188105 | |
| Anesthesia System | RWD | R640-S1 | |
| Cell Counter | Invitrogen | AMQAX1000 | |
| Cell Culture Dish | Corning | 430167 | |
| Cryoslicer | Thermo Fisher | CryoStar NX50 | |
| Dextrans-FITC-150kDa | WEIHUA BIO | WH007N07 | |
| Dextrans-FITC-4kDa | WEIHUA BIO | WH007N0705 | |
| Embedding Cassettes | CITOTEST | 80203-0007 | |
| Endothelial Cell Medium | ScienCell | 35809 | |
| Endothelial Growth Supplements | ScienCell | 1025 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10100147C | |
| Fibroblast Growth Factor 1 | AtaGenix | 9043p-082318-A01 | FGF1 |
| Fluorescence Microscope | Nikon | ECLIPSE Ni | |
| Heating Pad | Boruida | 30-50-30 | |
| Insulin Syringe | BD | 300841 | |
| Isoflurane | RWD | R510-22-10 | |
| Laboratory Balance | Sartorius | BSA124S-CW | |
| Matrigel | Corning | 356234 | Matrix gel |
| Medium 199 powder | Gibco | 31100-035 | |
| Microtubes | Axygen | MCT-150-C | |
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound | SUKURA | 4583 | Tissue embedding gel |
| Palmitate Acid | KunChuang | KC001 | |
| Penicillin-Streptomycin Liquid | Solarbio | P1400 | |
| Phosphate Buffer Saline | Solarbio | P1022 | |
| Surgical Instruments | RWD | RWD | |
| Tail Vein Injection Instrument | KEW BASIS | KW-XXY | |
| Trypsin-EDTA Solution | Solarbio | T1320 | |
| Ultra-Low Temperature Freezer | eppendorf | U410 | |
| Vascular Endothelial Growth Factor | CHAMOT | CM058-5HP | VEGF |
References
- Bikfalvi, A. History and conceptual developments in vascular biology and angiogenesis research: a personal view. Angiogenesis. 20 (4), 463-478 (2017).
- Carmeliet, P., Jain, R. Principles and mechanisms of vessel normalization for cancer and other angiogenic diseases. Nature reviews Drug discovery. 10 (6), 417-427 (2011).
- De Palma, M., Biziato, D., Petrova, T.
- Griffioen, A., Molema, G. Angiogenesis: potentials for pharmacologic intervention in the treatment of cancer, cardiovascular diseases, and chronic inflammation. Pharmacological reviews. 52 (2), 237-268 (2000).
- Viallard, C., Larrivée, B. Tumor angiogenesis and vascular normalization: alternative therapeutic targets. Angiogenesis. 20 (4), 409-426 (2017).
- Craig, M., Sumanas, S. ETS transcription factors in embryonic vascular development. Angiogenesis. 19 (3), 275-285 (2016).
- Losordo, D., Dimmeler, S. Therapeutic angiogenesis and vasculogenesis for ischemic disease. Part I: angiogenic cytokines. Circulation. 109 (21), 2487-2491 (2004).
- Folkman, J. Anti-angiogenesis-new concept for therapy of solid tumors. Annals of Surgery. 175 (3), 409-416 (1972).
- Folkman, J. Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease. Nature Medicine. 1 (1), 27-31 (1995).
- Folkman, J. Opinion - Angiogenesis: an organizing principle for drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 6 (4), 273-286 (2007).
- Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425-532 (2018).
- Fan, X., et al. Interleukin-1β augments the angiogenesis of endothelial progenitor cells in an NF-κB/CXCR7-dependent manner. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 24 (10), 5605-5614 (2020).
- Dai, X., et al. Nrf2 transcriptional upregulation of IDH2 to tune mitochondrial dynamics and rescue angiogenic function of diabetic EPCs. Redox Biology. 56, 102449 (2022).
- Yan, X., et al. Liraglutide Improves the Angiogenic Capability of EPC and Promotes Ischemic Angiogenesis in Mice under Diabetic Conditions through an Nrf2-Dependent Mechanism. Cells. 11 (23), 3821 (2022).
- Koh, W., Stratman, A., Sacharidou, A., Davis, G. In vitro three dimensional collagen matrix models of endothelial lumen formation during vasculogenesis and angiogenesis. Methods in enzymology. 443, 83-101 (2008).
- Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425-532 (2018).
- Malinda, K. In vivo matrigel migration and angiogenesis assay. Methods in molecular biology (Clifton, NJ). , 287-294 (2009).
- Rezzola, S., et al. In vitro and ex vivo retina angiogenesis assays. Angiogenesis. 17 (3), 429-442 (2014).
- Dai, Q., et al. FGF21 promotes ischaemic angiogenesis and endothelial progenitor cells function under diabetic conditions in an AMPK/NAD+-dependent manner. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 25 (6), 3091-3102 (2021).
- Gavard, J., Gutkind, J. S. VEGF controls endothelial-cell permeability by promoting the beta-arrestin-dependent endocytosis of VE-cadherin. Nature cell biology. 8 (11), 1223-1234 (2006).
- Birdsey, G. M., et al. The endothelial transcription factor ERG promotes vascular stability and growth through Wnt/β-catenin signaling. Developmental Cell. 32 (1), 82-96 (2015).
- Yan, X., et al. A Novel CXCR4 antagonist enhances angiogenesis via modifying the ischaemic tissue environment. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 21 (10), 2298-2307 (2017).
