Summary
פרוטוקול זה מתאר פלטפורמת תרבית תאים מבוססת קרום הניתנת להגדרה מחדש המשלבת את פורמט הבאר הפתוחה עם יכולות זרימת נוזלים. פלטפורמה זו תואמת לפרוטוקולים סטנדרטיים ומאפשרת מעברים הפיכים בין מצבי תרבית פתוחה ומיקרופלואידית, תוך מתן מענה לצרכים של מעבדות הנדסה וביו-מדע כאחד.
Abstract
מערכות מיקרופיזיולוגיות הן פלטפורמות ממוזערות של תרביות תאים המשמשות לחיקוי המבנה והתפקוד של רקמות אנושיות בתנאי מעבדה. עם זאת, פלטפורמות אלה לא זכו לאימוץ נרחב במעבדות ביו-מדעיות שבהן גישות פתוחות מבוססות ממברנה משמשות כתקן הזהב לחיקוי מחסומי רקמות, למרות שאין להן יכולות זרימת נוזלים. בעיה זו ניתן לייחס בעיקר את חוסר התאימות של מערכות מיקרופיזיולוגיות קיימות עם פרוטוקולים סטנדרטיים וכלים שפותחו עבור מערכות באר פתוחה.
כאן, אנו מציגים פרוטוקול ליצירת פלטפורמה מבוססת ממברנה הניתנת להגדרה מחדש עם מבנה באר פתוחה, יכולת שיפור זרימה ותאימות לפרוטוקולים קונבנציונליים. מערכת זו משתמשת בגישת הרכבה מגנטית המאפשרת מעבר הפיך בין מצב באר פתוחה למצב מיקרופלואיד. בגישה זו, למשתמשים יש את הגמישות להתחיל ניסוי בפורמט באר פתוחה באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים ולהוסיף או להסיר יכולות זרימה לפי הצורך. כדי להדגים את השימוש המעשי במערכת זו ואת התאמתה לטכניקות סטנדרטיות, הוקמה מונושכבה של תאי אנדותל בפורמט פתוח. המערכת הוגדרה מחדש כדי להכניס זרימת נוזלים ולאחר מכן עברה לפורמט באר פתוחה כדי לבצע אימונוסטיין ומיצוי RNA. בשל תאימותו לפרוטוקולי באר פתוחה קונבנציונליים ויכולת שיפור זרימה, תכנון זה הניתן להגדרה מחדש צפוי להיות מאומץ הן על ידי מעבדות הנדסה והן על ידי מעבדות ביו-מדעיות.
Introduction
מחסומי כלי הדם משמשים כממשק קריטי המפריד בין תא הדם לרקמה הסובבת אותו. הם ממלאים תפקיד קריטי בשימור הומאוסטזיס על ידי משיכת תאים חיסוניים, שליטה בחדירות מולקולרית והגנה מפני חדירת פתוגנים לרקמה 1,2. מודלים של תרביות חוץ גופיות פותחו כדי לחקות את המיקרו-סביבה in vivo, ומאפשרים חקירות שיטתיות של הגורמים והתנאים המשפיעים על תכונות המחסום במצבים בריאים וחוליםכאחד 3,4.
הגישה הנפוצה ביותר עבור מודלים כאלה של תרביות היא תצורת "באר פתוחה"5 דמוית Transwell, שבה קרום תרבית נקבובי חרוט מסילה מפריד בין תאים מלאים במדיה (איור 1A). בפורמט זה ניתן לזרוע תאים משני צדי הממברנה, ופותח מגוון רחב של פרוטוקולים ניסיוניים. עם זאת, מערכות אלה מוגבלות ביכולתן לספק את זרמי הנוזלים החיוניים לתמיכה בהבשלת מחסום ולחיקוי זרימת תאי מערכת החיסון הנראית in vivo 5,6. כתוצאה מכך, לא ניתן להשתמש בהם למחקרים הדורשים זרימות דינמיות המציגות מינוני תרופות, גירוי מכני או לחצים גזירים הנגרמים על ידי נוזל 6,7,8.
כדי להתגבר על המגבלות של מערכות באר פתוחה, פותחו פלטפורמות מיקרופלואידיות המשלבות קרומי תרבית נקבוביות עם תעלות פלואידיות הניתנות להתייחסות בנפרד9. פלטפורמות אלה מציעות שליטה מדויקת על ניתוב נוזלים, זילוח והכנסת תרכובות כימיות, גירוי גזירה מבוקר ויכולות חיבור תאים דינמיות 7,10,11,12,13. למרות היכולות המתקדמות שמספקות פלטפורמות מיקרופלואידיות, הן לא ראו אימוץ נרחב במעבדות ביו-מדעיות בשל פרוטוקולים מיקרופלואידים מורכבים וחוסר התאמתם לתהליכי עבודה ניסיוניים מבוססים 4,10,14.
כדי לגשר על הפער בין טכנולוגיות אלה, אנו מציגים פרוטוקול המשתמש במערכת מגנטית הניתנת להגדרה מחדש, מבוססת מודולים. מערכת זו ניתנת להחלפה בקלות בין מצב באר פתוחה למצב מיקרופלואיד בהתבסס על הצרכים הספציפיים של הניסוי. הפלטפורמה כוללת התקן באר פתוחה, המכונה m-μSiM (מערכת מיקרופיזיולוגית מודולרית המופעלת על ידי קרום סיליקון), עם קרום תרבית בעובי 100 ננומטר (ננו-ממברנה). לנומברנה זו נקבוביות גבוהה (15%) ושקיפות דמוית זכוכית, כפי שמודגם באיור 1B. הוא מפריד פיזית את התא העליון מהתעלה התחתונה, ומאפשר הובלה מולקולרית על פני סקאלות אורך פיזיולוגיות15. שלא כמו ממברנות קונבנציונליות חרוטות מסלול, שיש להן אתגרים ידועים בדימות תאים חיים עם דימות שדה בהיר, התכונות האופטיות והפיזיקליות החיוביות של הננו-ממברנה מאפשרות הדמיה ברורה של תאים משני צדי משטח הממברנה 15,16,17.
הפרוטוקול הנוכחי מתאר את הייצור של מודולי זריעה וזרימה מיוחדים ומסביר את התצורה המגנטית מחדש של הפלטפורמה. הוא מדגים כיצד ניתן להשתמש בפלטפורמה כדי ליצור מחסומי אנדותל בתנאים סטטיים ודינמיים כאחד. הדגמה זו מגלה כי תאי אנדותל מתיישרים לאורך כיוון הזרימה, עם ויסות מוגבר של מטרות גנים רגישות לגזירה תחת גירוי גזירה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ניתן להשתמש בעיצוב זה במצבים שונים בהתבסס על דרישות ניסיוניות והעדפות משתמש הקצה. לפני כל ניסוי, עיין בתרשים זרימת ההחלטות המוצג באיור 2 כדי לקבוע את השלבים והמודולים הדרושים עבור הפרוטוקול. לדוגמה, אם המשתמש מתכוון לשמור על תבנית הבאר הפתוחה במהלך ניסוי כדי להשוות אותה ישירות למערכת מסוג Transwell, הסטנסיל של תבנית אינו נדרש לזריעת תאים. מודול הליבה זמין מסחרית (ראה טבלת חומרים), וניתן לבחור את הננוממברנה הדקה במיוחד מתוך ספרייה של חומרים עם נקבוביות וגדלי נקבוביות שונים כדי להתאים לצרכים ניסיוניים.
1. ייצור שבלונה של דוגמאות
הערה: שבלונה של תבניות משמשת למיקום תאים באופן בלעדי על האזור הנקבובי של שבב הממברנה, ומונעת מתאים להתיישב על שכבת הסיליקון שמסביב, שם הם עלולים לחוות נזק לאחר הוספת מודול הזרימה16 (עיין באיור 3). נזק לשכבה החד-שכבתית עלול להשפיע לרעה על שלמות המחסום ולפגוע בתוצאות הניסוי. השבלונה מיותרת בתרבות פתוחה וסטטית, שכן אין סיכון לנזק.
- רכישה, מכונה או הדפסה תלת-ממדית של תבנית באמצעות העיצוב המופיע בקובץ קידוד משלים 1 (איור 4A).
הערה: קירות הסטנסיל מחודדים כדי להגדיל את קיבולת המדיה ולמזער את השמנת הבועות בהשוואה לתכונות בעלות יחס גובה-רוחב גבוה עם קירות ישרים. - חבר סרט דבק רגיש ללחץ (PSA) בגודל 130 מיקרומטר ליריעת אקריליק בקוטר 3.2 מ"מ באמצעות גליל קר (ראה טבלת חומרים).
- חיתוך בלייזר של יריעת האקריליק בהתאם לתכנון המופיע בקובץ קידוד משלים 2 ליצירת מערך של חללים (איור 4B).
- מקלפים את שכבת המגן מסרט ה-PSA ומחברים את יריעת האקריליק לתבנית.
הערה: ודא שהיריעה שנחתכה בלייזר מיושרת עם התבנית, כך שתכונות התבנית ממורכזות בתוך החלל (איור 4C). הדיוק של מיקום התא על הממברנה תלוי בשלב זה. - ערבבו היטב את הפרה-פולימר PDMS (תוך שימוש ביחס בסיס לזרז של 10:1) (ראו טבלת חומרים) ונטרלו אותו בתא ואקום עד שלא יישארו בועות נראות לעין (5-15 דקות).
- לאט לשפוך את PDMS לתוך חללי עובש, פילוס אותו עם קצה שטוח.
הערה: כדי למנוע לכידה של בועות, שפכו את ה-PDMS לתוך כל חלל באיטיות. אם יש בועות לאחר המזיגה, מניחים את התבנית בתא הוואקום ומפרקים אותה שוב. - רפאו את ה-PDMS על פלטה חמה בטמפרטורה של 70°C למשך שעה אחת, ולאחר מכן הניחו לו להתקרר לטמפרטורת החדר.
- חילצו את השבלונות מחללי התבנית באמצעות פינצטה שטוחה.
2. ייצור מודול הזרימה
הערה: מודול הזרימה חולק טביעת רגל דומה עם הבאר בצורת תלתן של מודול הליבה וכולל מיקרו-ערוץ יצוק (רוחב = 1.5 מ"מ, גובה = 0.2 מ"מ, אורך = 5 מ"מ). צורת התלתן מסייעת ליישר את התעלה מעל אזור התרבית הנקבובית (איור 5).
- השתמש בטכניקות סטנדרטיות של ליתוגרפיה רכה18 כדי ליצור תבנית סיליקון עם תכונות המוגדרות על-ידי העיצוב המסופק בקובץ קידוד משלים 3 (איור 4D).
- חבר סרט PSA של 130 מיקרומטר ליריעת אקריליק בעובי 3.2 מ"מ.
- חתך בלייזר את יריעת האקריליק בהתבסס על העיצוב שניתן בקובץ קידוד משלים 4 כדי ליצור מערך של חללים בצורת תלתן (איור 4E).
הערה: גובה החלל קובע את גובה מודול הזרימה, אשר חייב להיות מעט גבוה יותר (על ידי 0-0.1 מ"מ) מאשר גובה מודול הליבה היטב כדי להבטיח איטום נאות. - הסר את שכבת ההגנה מסרט ה- PSA ולאחר מכן חבר את היריעה שנחתכה בלייזר לתבנית הסיליקון על ידי יישור סימני היישור המשולשים על תבנית הסיליקון עם אלה שעל היריעה שנחתכה בלייזר.
הערה: בדומה לשלב 1.4, ודא שיריעת האקריליק החתוכה בלייזר מיושרת עם תבנית הסיליקון כך שתכונות התבנית ממורכזות בתוך כל חלל (איור 4F). שלב זה קובע את מיקום המיקרו-ערוץ ביחס לטביעת הרגל. - שפכו באיטיות את ה-PDMS נטול הגז על חללי התבנית ויישרו אותו עם קצה שטוח.
הערה: אם יש בועות לאחר המזיגה, יש לנטרל את התבנית עד להסרת הבועות. - מניחים את התבנית על פלטה ואופים את ה-PDMS בטמפרטורה של 70°C למשך שעה אחת, ולאחר מכן מניחים לתבנית להתקרר לטמפרטורת החדר.
- הסר בזהירות את מודולי הזרימה מחללי התבנית באמצעות פינצטה שטוחה.
- כוון את מודול הזרימה כאשר תכונות המיקרו-ערוץ פונות כלפי מעלה, ומקם את פתחי הכניסה והיציאה של הליבה בקצה התעלה באמצעות ניקוב ביופסיה (ראה טבלת חומרים).
3. ייצור בתי אקריליק תחתונים ועליונים
הערה: מודול הליבה מתאים למעטפת התחתונה. המשיכה בין מגנטים משובצים במעטפת דוחסת ואוטמת את מודול הזרימה למודול הליבה (איור 6).
- חתכו בלייזר יריעת אקריליק 2 מ"מ באמצעות העיצוב המופיע בקובץ קידוד משלים 5 ליצירת המעטפת העליונה עם חורים להחדרת מגנט.
- חבר סרט PSA של 130 מיקרומטר ליריעת אקריליק 3.5 מ"מ.
- חתכו בלייזר את יריעת האקריליק בהתאם לתכנון שניתן בקובץ קידוד משלים 6 ליצירת המעטפת התחתונה עם חורים להחדרת מגנט.
הערה: עובי המארז התחתון הוא פרמטר קריטי וחייב להתאים לעובי הכולל של מודול הליבה כדי למנוע דליפה במהלך הזרימה. - הסר את שכבת המגן PSA וחבר את המארז התחתון לכיסוי זכוכית.
- התאמת לחיצה, מגנטים ניאודימיום מצופים ניקל בקוטר 4.75 מ"מ (ראו טבלת חומרים) לתוך החורים שנחתכו בלייזר של המארזים.
הערה: ודאו שהמגנטים בבתים התחתונים והעליונים ממוקמים בקוטביות הפוכה כדי להבטיח משיכה מגנטית (איור 6).
4. ייצור מעגל הזרימה
הערה: מעגל הזרימה בלולאה סגורה מכיל שני בקבוקוני איסוף דגימות כמאגרים (איור 7). מאגר הכניסה כולל מסנן פוליווינילידן דיפלואוריד (PVDF) כדי לאפשר למדיה התאית להתאזן עם ריכוזCO2 באינקובטור.
- השתמש בניקוב ביופסיה של 1 מ"מ כדי ליצור שני חורים במכסה של בקבוקון איסוף דגימות.
- השתמשו באגרופים ביופסיים כדי ליצור שני חורים (1 מ"מ ו-4 מ"מ) במכסה של בקבוקון איסוף דגימות נפרד, וצרו חור של 1 מ"מ בחלק התחתון של בקבוקון זה.
- הכניסו 20 קצוות חלוקה לכל אחד מהחורים בקוטר 1 מ"מ ואטמו אותם בדבק חם.
- הניחו מסנן PVDF בגודל 0.22 מיקרומטר (ראו טבלת חומרים) בחור בגודל 4 מ"מ ואטמו אותו בדבק חם.
- חתכו בלייזר יריעת אקריליק בקוטר 1.5 מ"מ באמצעות העיצוב המופיע בקובץ קידוד משלים 7 ליצירת שלב החזקת דגימה.
- מקמו את המאגרים על הבמה האקרילית.
- חבר את קצות החלוקה באמצעות צינורות זרימה זעירים (ראה טבלת חומרים).
- חבר את הצינורות לכניסה וליציאה של מודול הזרימה באמצעות קצוות חלוקה של 21 G.
- השתמשו במשאבה פריסטלטית (ראו טבלת חומרים) לזרימת זרימה.
הערה: מזרק או משאבות פניאומטיות יכול לשמש גם כדי להציג זרימה אם תרצה. קצב הזרימה צריך להיקבע על פי צרכי הניסוי. טבלה מקיפה, הנגזרת ממודל COMSOL שאושר בניסוי, מסופקת בטבלה משלימה 1 כדי לסייע למשתמשים לבחור את קצב הזרימה הדרוש להשגת לחץ הגזירה הרצוי בשכבה16 של התא.
5. זריעת תאים
הערה: בדומה לתוספות ממברנה קונבנציונליות, ניתן לגדל סוגי תאים שונים בתרבית על הננו-ממברנה. סוג תא משני יכול גם להיות בתרבית משותפת בצד השני של הממברנה בתעלה התחתונה15.
- צפו את הממברנה ב-5 מיקרוגרם/ס"מ2 של פיברונקטין (ראו טבלת חומרים) בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת כדי לשפר את חיבור התא.
הערה: סוג התא שנבחר עשוי להשפיע על הציפוי הנדרש ועל צפיפות התא. ההליך המתואר כאן מיועד לתאי אנדותל של ורידים טבוריים אנושיים (HUVECs, ראה טבלת חומרים). - שאפו את תמיסת הציפוי באמצעות פיפטה P200 והניחו שבלונה עם דוגמאות היטב במודול הליבה.
- הוסף מדיה סלולרית לבאר ולערוץ התחתון של המכשיר.
- זרעו HUVECs בצפיפות של 40,000 תאים לסמ"ק2 לתוך הבאר.
הערה: HUVECs בצפיפות זו בדרך כלל יוצרים חד-שכבה מתמזגת לאחר 24 שעות של דגירה16,19. - הניחו את המכשיר בצלחת פטרי. הוסיפו מכסה צינור חרוטי בנפח 15 מ"ל עם מי DI לצלחת הפטרי כדי לשמור על לחות מקומית.
- מעבירים את צלחת הפטרי לאינקובטור.
הערה: יש להחליף מדיה סלולרית בבאר העליונה ובערוץ התחתון של המכשיר כל 24 שעות. כדי לשנות את המדיה בערוץ התחתון, הזריק בעדינות מדיה טרייה לאחת היציאות כדי להזיז את המדיה הישנה מהיציאה השנייה.
6. תצורה מחדש למצב מיקרופלואידי
- יש לעקר את המעטפת העליונה, המעטפת התחתונה, מודול הזרימה, המאגרים, הצינורות וקצות הניפוק על ידי הכנסתם לתא עיקור UV למשך 30 דקות לפני ההרכבה. להפיץ 70% אתנול ולאחר מכן PBS סטרילי במעגל הזרימה.
- מלאו את המאגרים והצינורות במצע צמיחת תאי אנדותל (ראו טבלת חומרים).
- מקם את הדיור התחתון על שלב המדגם. הכנס את מודול הליבה הפתוח לתוך המארז התחתון.
- שאפו מדיה סלולרית מהבאר של המודול. מניחים את מודול הזרימה בבאר.
- מקם את המארז העליון כדי לאטום היטב את מודול הזרימה במודול הליבה. חבר את עצות החלוקה של הכניסה והשקע ליציאות מודול הזרימה.
- הפעל את המשאבה הפריסטלטית כדי להכניס זרימת נוזלים למערכת.
7. ביצוע ניתוח במורד הזרם בפורמט באר פתוחה לאחר הכנסת זרימה
הערה: זמן התרבות כאן תלוי במטרות הניסוי. משתמשים יכולים לבצע ניתוח במורד הזרם (למשל, אימונוציטוכימיה, מיצוי RNA) בפורמט באר פתוחה או מיקרופלואידית על פי העדפתם. לדוגמה, אם מעדיפים פורמט של באר פתוחה, יש להגדיר מחדש את המערכת לביצוע בדיקות בהתבסס על פרוטוקולים סטנדרטיים16,19.
- יש להפסיק את הפעלת המשאבה כאשר מגיעים לזמן הרצוי לחשיפה לזרימת גזירה. הסר את עצות ניפוק הכניסה והיציאה.
- הסר את הדיור העליון. הסר בעדינות את מודול הזרימה מהבאר באמצעות פינצטה.
- הוסף 100 μL של מדיה סלולרית לבאר. בצע בדיקות רצויות בהתבסס על פרוטוקולים סטנדרטיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מודול הליבה הפתוח ממוקם בתחילה בתוך חלל ספציפי שנוצר על-ידי בית תחתון וכיסוי, כפי שמודגם באיור 6A. לאחר מכן, מודול הזרימה, הכולל מיקרו-ערוץ ויציאות גישה, מוכנס לבאר של מודול הליבה. מודול הזרימה אטום היטב כנגד שכבת התמיכה בסיליקון של הממברנה עקב כוח המשיכה המגנטי בין מגנטים המוטבעים במעטפת התחתונה והעליונה, כפי שמתואר באיור 6B. כדי להעריך את יעילותו של מנגנון הצמדה מגנטי זה, נערכה בדיקת לחץ פרץ, שהראתה כי המערכת יכולה לעמוד בלחצים ללא מוצא של עד 38.8 ± 2.4 kPa. עמידות זו ללחץ עולה באופן משמעותי על לחצי ההפעלה האופייניים הנתקלים ביישומי תרביות תאים. יתר על כן, המערכת נשארת נקייה מדליפות כאשר היא נתונה לקצבי זרימה של עד 4000 מיקרוליטר/דקה, המקבילים ללחץ גזירה של 74 דינים לסמ"ק2 באזור התרבית16.
בעת פיתוח פלטפורמה שיכולה לעבור בין מצב באר פתוחה למצב מיקרופלואיד, יש לתת את הדעת בזהירות לגישת זריעת התא, שאינה מטרידה בדרך כלל פלטפורמות באר פתוחה סטטיות קונבנציונליות16. נזק לשכבה החד-שכבתית סביב גבול התעלה עלול לגרום לסיבוכים בתוצאות הניסוי20. כדי לטפל בבעיה זו, תוכננה שבלונה נשלפת שמתאימה לבאר הפתוחה של מודול הליבה ומספקת חלון ספציפי לתאים להתיישב באופן מועדף על פני הממברנה (איור 3). ברגע שחד-שכבת התא מעוצבת ומגיעה למפגש, למשתמש יש את הגמישות להמשיך את הניסוי בפורמט באר פתוחה או להגדיר מחדש את הפלטפורמה למצב מיקרופלואיד כדי לחשוף את חד-שכבת התא לעקה פיזיולוגית של גזירה (איור 3). מנגנון ההצמדה המגנטי מספק את היכולת לעבור בקלות בין הפורמט הפתוח והמיקרופלואיד לפי הצורך. לדוגמה, ניתן להחזיר את המכשיר לפורמט הבאר הפתוחה לאחר גירוי זרימה, מה שמציע למשתמשים את הגמישות לבצע מגוון בדיקות (כגון אימונוסטינינג, מיצוי RNA ומדידות חדירות מולקולרית) באמצעות פרוטוקולים ניסיוניים סטנדרטיים15,16.
בסביבה הפיזיולוגית של גוף האדם, מחסום כלי הדם חשוף ללחץ גזירה הנגרם על ידי זרימה, המשמש רמז ביופיזי מרכזי המשפיע על המבנה והתפקוד של המחסום 5,21,22. לפיכך, תוספת של זרימת נוזלים במערכות מיקרופיזיולוגיות היא דרישת מפתח. כדי להדגים את הרבגוניות של הפלטפורמה, הוקמה שכבת HUVEC בפורמט פתוח באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים. לאחר 24 שעות של תרבית סטטית, הפלטפורמה הוגדרה מחדש למצב מיקרופלואידי כדי לחשוף את חד-שכבת התא ללחץ גזירה של 10.7 דינים לסמ"מלמשך 24 שעות. התוצאות הצביעו על כך שתאים שגודלו בתרבית תחת זרימה הסתדרו לאורך כיוון הזרימה, בעוד שתאים שגודלו בתרבית ללא זרימה נשארו בכיוון אקראי (איור 8A,B). לאחר גירוי גזירה, הפלטפורמה הוגדרה מחדש לפורמט באר פתוחה כדי לחלץ RNA באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים. התוצאות הצביעו על כך שחשיפת התאים ללחץ גזירה הביאה להגברת הרגולציה של גורם דמוי קרופל 2 (KLF2) וסינתאז תחמוצת החנקן האנדותל (eNOS), הממלאים תפקידים קריטיים כגון פונקציות נוגדות טרומבוטיקה והגנה על עורקים בכלי דם בריאים23,24 (איור 8C).
איור 1: השוואה בין מודלים של מחסום כלי דם במבחנה . איור סכמטי של (A) תוספות רגילות דמויות Transwell ו-(B) m-μSiM באר פתוחה. תמונות שדה בהיר של חד-שכבה HUVEC מדגישות את ההבדל באיכות ההדמיה של שדה בהיר בין קרום חרוט מסילה לבין ננו-קרום דק במיוחד. פסי קנה מידה = 100 מיקרומטר. מעובד מתוך Mansouri et al.16. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: תרשים זרימה של קבלת החלטות. תרשים זרימה המבוסס על צרכי הניסוי והעדפות ניתוח במורד הזרם. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: זרימת עבודה ניסיונית של הפלטפורמה. (A) כדי למקם תאים ישירות על הממברנה הנקבובית, מכניסים שבלונה נשלפת של תבנית לבאר של מודול הליבה (הכניסה מראה תאים עם דוגמאות, קווים צהובים מציגים גבולות מיקרו-ערוץ). (B) ניתן לשמור או להסיר את השבלונה במכשיר לצורך תרבית תאים סטטית. (C) כדי להגדיר מחדש את הפלטפורמה למצב מיקרופלואידי, הסטנסיל מוחלף במודול הזרימה. בגלל מנגנון האיטום המגנטי, התצורה הפיכה; ניתן להסיר את הבתים ואת מודול הזרימה כדי לעבור למצב באר פתוחה. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. מעובד מתוך Mansouri et al.16. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: המחשה סכמטית של התבניות. (A) תבנית השבלונה. (B) יריעת אקריליק בחיתוך לייזר. (C) תצוגה מורכבת של תבנית השבלונה. (D) תבנית מודול זרימה. (E) יריעת אקריליק בחיתוך לייזר. (F) תצוגה מורכבת של תבנית מודול הזרימה. מאפיינים בצורת משולש הם סימני יישור כדי להקל על חיבור יריעות אקריליק לתבניות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: סכמה של מודול הזרימה בצורת תלתן. (A) ממשק המגע בין מודול הזרימה לבין שבב הממברנה. יציאות הכניסה והיציאה לזרימת נוזלים מוצגות בוורוד. (B) תמונה תלת-ממדית של מודול זרימת PDMS. מעובד מתוך Mansouri et al.16. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: הרכבה מגנטית להגדרה מחדש של התקנים. (A) הדגמה סכמטית של רכיבים להגדרה מחדש של ההתקן למצב מיקרופלואידי. מגנטים משובצים עם מוטות מנוגדים מעוררים משיכה לאיטום. (B) מבט חתך רוחב של ההתקן שהוגדר מחדש המציג את תעלת כלי הדם בוורוד ואת תא הרקמה בירוק. מעובד מתוך Mansouri et al.16. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: תצוגה מורכבת של מעגל הזרימה. המעגל מורכב ממשאבה פריסטלטית, שני מאגרים לאספקת מדיה תאית ותנודות שיכוך, צינורות ובמה אקרילית להחזקת הרכיבים במקומם. מעובד מתוך Mansouri et al.16. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 8: השוואה בין HUVECs בתרבית במצב באר פתוחה ומיקרופלואידית. התאים נזרעו וגודלו בתרבית בבאר פתוחה במשך 24 שעות כדי ליצור חד-שכבה מתמזגת. במהלך 24 השעות שלאחר מכן, קבוצה אחת של התקנים הוגדרה מחדש למצב מיקרופלואיד. (A) תאים בתרבית תחת זרימה (10.7 dynes.cm-2 עקות גזירה) מיושרים לאורך כיוון הזרימה (הכניסה מראה אקטין וגרעיני תאים בירוק ובכחול, בהתאמה). (B) תאים שגודלו בתרבית ללא זרימה בתבנית באר פתוחה לא הראו יישור. אורך הפסים בחלקות מכ"ם מציג את מספר התאים בכיוון המתאים. (C) תאים שגודלו בתרבית תחת זרימה הראו עלייה גבוהה יותר ברגולציה של גנים KLF2 ו-eNOS בהשוואה למצב אי-זרימה (**p < 0.01, n = 3, ממוצע ± SD). פסי קנה מידה = 100 מיקרומטר. מעובד מתוך Mansouri et al.16. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
טבלה משלימה 1: לחץ גזירה על פני השטח של הננוממברנה בקצבי זרימה שונים. טבלה זו מספקת מידע על ערכי עקת גזירה על פני השטח של הננוממברנה בקצבי זרימה שונים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
קובץ קידוד משלים 1: מודל CAD של תבנית השבלונה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
קובץ קידוד משלים 2: מודל CAD של חללים חתוכים בלייזר עבור תבנית השבלונה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
קובץ קידוד משלים 3: מודל CAD של מודול הזרימה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
קובץ קידוד משלים 4: מודל CAD של חללים חתוכים בלייזר עבור תבנית מודול הזרימה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
קובץ קידוד משלים 5: מודל CAD של הדיור העליון. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
קובץ קידוד משלים 6: מודל CAD של הדיור התחתון. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
קובץ קידוד משלים 7: מודל CAD של השלב האקרילי. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מטרת פרוטוקול זה היא לפתח שיטה מעשית לשילוב יכולות זרימה בפלטפורמת באר פתוחה הכוללת ננו-ממברנה דקה במיוחד. בתכנון זה נעשה שימוש בגישת הצמדה מגנטית, המאפשרת מעבר בין מצב באר פתוחה למצב זורם במהלך ניסויים ושילוב היתרונות של שתי הגישות. שלא כמו פלטפורמות קונבנציונליות מלוכדות לצמיתות, הצמדה מגנטית מאפשרת לפרק את הפלטפורמה בנקודות נוחות במהלך זרימת העבודה הניסיונית 16,25,26,27. בפלטפורמה זו זורעים תאים, והמחסום מוקם בפורמט המוכר של באר פתוחה, ואז המערכת מוגדרת מחדש למצב זורם פשוט על ידי הוספת מודול זרימה ואטימה מגנטית שלו. תצורה מחדש זו מציעה שני יתרונות מרכזיים: ראשית, היא מאפשרת סימולציה של מצבים פיזיולוגיים על ידי חשיפת חד-שכבת התא ללחץ גזירה המושרה על ידי נוזל; שנית, הוא מאפשר הכנסת רכיבים משניים כמו תאי מערכת החיסון בתנאי זרימה16. תכונת ההצמדה המגנטית מציעה שיטת הרכבה ללא כלים, המאפשרת מעבר לפי דרישה בין פורמטים של באר פתוחה ומיקרופלואידית. כתוצאה מכך, ניתוחים במורד הזרם, כגון אימונוציטוכימיה ומיצוי RNA, יכולים להתבצע בפורמט הבאר הפתוחה המוכר באמצעות טכניקות סטנדרטיות או שימוש בטכניקות מיקרופלואידיות לפי הצורך16.
איטום מגנטי הוא פרמטר קריטי בתכנון המאפשר הגדרה מחדש של הפלטפורמה, ולכן נדרשים מספר שיקולים לתפקודה המדויק: (1) גובה המארז התחתון חייב להתאים לגובה מודול הליבה (סובלנות: ±0.1 מ"מ) כדי לתחום את המודול כראוי. (2) גובה מודול הזרימה חייב להיות מעט גבוה יותר מהבאר של מודול הליבה (0-0.1 מ"מ). (3) תכנון זה ניתן להתאמה למגוון רחב של חומרים ואינו מחייב שמודול הזרימה ייבנה מחומרים אלסטומריים. האלמנט המכריע הוא לשלב חומר רך דמוי אטם בממשק שבין מודול הזרימה לבין שבב הממברנה כדי ליצור אטם אמין. (4) יש למטב את קוטר החללים החתוכים בלייזר במארזים להתאמת מגנטים ללחיצה בהתאם למכשיר המשמש28. מגנטים עלולים להתנתק ולהוביל לדליפת זרימה אם קוטר החלל גדול מדי, או שבתים עלולים להיסדק במהלך החדרת המגנט אם החללים קטנים מדי. על ידי ביצוע השיקולים הנ"ל, ניתן ליישם את גישת ההרכבה המגנטית שהוצגה כאן כדי להגדיר מחדש מערכות באר פתוחה אחרות למצב מיקרופלואיד.
כדי לקבל את יכולת ההגדרה מחדש, יש צורך להשתמש בסטנסיל דפוס המאפשר מיקום מדויק של תאים על פני הממברנה. השבלונה מבטיחה שלא יהיו תאים מחוץ לאזור התרבית הנקבובית (כלומר, באזור תמיכת הסיליקון), אשר עלול להיפגע עם החדרת מודול הזרימה. היבט זה הופך להיות חיוני במיוחד במודלים של תרביות משותפות מכיוון שתאים שנזרעו בשוגג במקומות לא מכוונים אינם יכולים להשתתף באופן פעיל בפיתוח רקמת המחסום. עם זאת, תאים אלה שאינם במקומם נשלפים בדרך כלל במהלך תהליך הליזה ועלולים לגרום להטיה במחקרי ביטוי גנים החוקרים אינטראקציות בין תאים על פני הממברנה20. זריעה של תאים פתוחים באמצעות השבלונה משפרת את יעילות הזריעה על ידי הפחתת הפסדי תאים לאורך נתיב הזרימה, הטבועים בפלטפורמות מיקרופלואידיות קונבנציונליות 4,16. פלטפורמה זו מסוגלת גם לשלב סוגי תאים מרובים וחומרי ECM 15,16,17. לדוגמה, הידרוג'ל עמוס תאים יכול להיות מוזרק לתוך התעלה התחתונה של המכשיר כדי לחקות את תא הרקמה בעוד אנדותל מוקם על גבי הממברנה.
למרות שניתן לעשות שימוש חוזר במודולים וברכיבים המגנטיים, שמירה על איטום יעיל על פני מספר שימושים יכולה להוות בעיה בגלל שהמגנטים מתרופפים בבית ומפחיתים את כוח האיטום. ניתן להקל על בעיה זו על ידי יצירת מודולים למינציה חדשים עבור כל ניסוי או רכיבים לייצור המוני באמצעות הזרקה או טכניקות הדפסה תלת ממדית לאחר קביעת עיצובים. בשיטה המתוארת בפרוטוקול זה, מודול הזרימה ממוקם ידנית במודול הליבה, ויכולת הריבוב והאוטומציה של המערכת מוגבלת. כדי לשפר את התפוקה הניסיונית, ניתן לשלב את מודול הזרימה והמעטפת העליונה במודול פונקציונלי אחד המכיל תעלות ניתוב פנימיות וחיבורי צינורות סטנדרטיים המחוררים בו זמנית מספר מודולים במקביל.
רכיבים של מודול הליבה הפתוח מיוצרים בייצור המוני וזמינים מסחרית. רכיבים אחרים של המערכת, כגון מודול הזרימה, המעטפת וסטנסיל התבניות, יכולים גם הם להיות מיוצרים בקנה מידה גדול. יתר על כן, יכולת ההגדרה מחדש של הפלטפורמה מאפשרת הוספת חיישנים ומפעילים (למשל, מודול התנגדות חשמלית טרנסאנדותליאלית, מודול אלקטרופורציה) לגירוי ומדידות בזמן אמת. בסך הכל, פלטפורמה זו משלבת גישות קונבנציונליות ומיקרופלואידיות כדי לסייע בתמיכה בשימוש נרחב מחוץ למעבדות הנדסה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
J.L.M. הוא מייסד שותף של SiMPore, Inc. ומחזיק במניות החברה. SiMPore ממסחרת את הטכנולוגיות מבוססות הסיליקון האולטרה-דקיקות, כולל הממברנות המשמשות במחקר זה.
Acknowledgments
מחקר זה מומן בחלקו על ידי המכון הלאומי לבריאות תחת מספרי פרסים R43GM137651, R61HL154249, R16GM146687 ומענק NSF CBET 2150798. המחברים מודים ל-RIT Machine Shop על ייצור עובש אלומיניום. התוכן הוא באחריותם הבלעדית של המחברים ואינו מייצג בהכרח את הדעות הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 x 0.86 Micro Flow tubes | Langer Instruments | WX10-14 & DG Series | |
| 1 mm Disposable Biopsy Punches, Integra Miltex | VWR | 95039-090 | |
| 1x PBS 7.4 pH | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| 20 GAUGE IT SERIES DISPENSING TIP | Jensen Global | JG20-1.5X | |
| 21 GAUGE NT PREMIUM SERIES ANGLED DISPENSING TIP | Jensen Global | JG21-1.0HPX-90 | |
| 3M 467 MP Pressure senstitive adhesive (PSA) | DigiKey | 3M9726-ND | |
| 3M 468 MP Pressure senstitive adhesive (PSA) | DigiKey | 3M9720-ND | |
| AlexaFluor 488 conjugated phalloidin | ThermoFisher Scientific | A12379 | |
| Applied Biosystems TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444556 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, 98%, Reagent grade, Alfa Aesar, Size = 10 g | VWR | AAJ64100-09 | |
| Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet | McMaster-Carr | 8560K171 | 12" x 12" x 1/16" |
| Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet | McMaster-Carr | 8589K31 | 12" x 12" x 3/32" |
| Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet | McMaster-Carr | 8560K191 | 12" x 12" x 7.64" |
| Corning Fibronectin, Human, 1 mg | Corning | 47743-728 | |
| Cover Glasses, Globe Scientific, L x W = 24 x 60 mm | VWR | 10118-677 | |
| DOW SYLGARD 184 SILICONE ENCAPSULANT CLEAR 0.5 KG KIT | Ellsworth Adhesives | 4019862 | |
| EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | |
| Fixture A1&A2 | SiMPore Inc. | NA | |
| Fixture B1&B2 | SiMPore Inc. | NA | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 4374966 | |
| Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) | ThermoFisher Scientific | C0035C | |
| LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570) | Thermo Fisher Scientific | R37601 | |
| Molecular Probes Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Nickel-plated magnets (4.75 mm diameter, 0.34 kg pull force) | K&J Magnetics | D31 | 3/16" dia. x 1/16" thick |
| Paraformaldehyde, 4% w/v aq. soln., methanol free, Alfa Aesar | Fisher Scientific | aa47392-9M | |
| Peristaltic Pump | Langer Instruments | BQ50-1J-A | |
| Photoresist SU-8 developer solution | Fisher Scientific | NC9901158 | |
| PVDF syringe filters | PerkinElmer | 2542913 | |
| Silicon wafer | University wafer,USA | 1196 | |
| SU-8 3050 | Fisher Scientific | NC0702369 | |
| Target gene: eNOS (Hs01574659_m1) | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
| Target gene: GAPDH (Hs02786624_g1) | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
| Target gene: KLF2 (Hs00360439_g1) | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
| Thermo Scientific Pierce 20x PBS Tween 20 | Thermo Fisher Scientific | 28352 | |
| Transport Tube Sample White caps, 5 mL, Sterile | VWR | 100500-422 | |
| TRI-reagent | ThermoFisher Scientific | AM9738 | |
| Ultrathin Nanoporous Membrane Chip | SiMPore Inc. | NPSN100-1L | The design is compatible with all of SiMPore membranes |
| uSiM component 1 | SiMPore Inc. | NA | |
| uSiM component 2 | SiMPore Inc. | NA |
References
- Claesson-Welsh, L., Dejana, E., McDonald, D. M. Permeability of the Endothelial Barrier: Identifying and Reconciling Controversies. Trends in Molecular Medicine. 27 (4), 314-331 (2021).
- Vera, D., et al. Engineering tissue barrier models on hydrogel microfluidic platforms. ACS Applied Materials & Interfaces. 13 (12), 13920-13933 (2021).
- Wang, Y. I., Abaci, H. E., Shuler, M. L. Microfluidic blood-brain barrier model provides in vivo-like barrier properties for drug permeability screening. Biotechnology and Bioengineering. 114 (1), 184-194 (2017).
- Sakolish, C. M., Esch, M. B., Hickman, J. J., Shuler, M. L., Mahler, G. J. Modeling barrier tissues in vitro: methods, achievements, and challenges. eBioMedicine. 5, 30-39 (2016).
- Kaisar, M. A., et al. New experimental models of the blood-brain barrier for CNS drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 12 (1), 89-103 (2017).
- Tan, K., et al. A high-throughput microfluidic microphysiological system (PREDICT-96) to recapitulate hepatocyte function in dynamic, re-circulating flow conditions. Lab on a Chip. 19 (9), 1556-1566 (2019).
- Ayuso, J. M., Virumbrales-Muñoz, M., Lang, J. M., Beebe, D. J. A role for microfluidic systems in precision medicine. Nature Communications. 13 (1), 3086 (2022).
- Katt, M. E., Shusta, E. V. In vitro models of the blood-brain barrier: building in physiological complexity. Current Opinion in Chemical Engineering. 30, 42-52 (2020).
- Ingber, D. E. Human organs-on-chips for disease modelling, drug development and personalized medicine. Nature Reviews Genetics. 23 (8), 467-491 (2022).
- Duncombe, T. A., Tentori, A. M., Herr, A. E.
- Williams, M. J., et al. A low-cost, rapidly integrated debubbler (rid) module for microfluidic cell culture applications. Micromachines. 10 (6), 360 (2019).
- Ahmed, A., et al. Engineering fiber anisotropy within natural collagen hydrogels. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 320 (6), C1112-C1124 (2021).
- Ahmed, A., et al. Microengineered 3D collagen gels with independently tunable fiber anisotropy and directionality. Advanced Materials Technologies. 6 (4), 2001186 (2021).
- Łach, A., Wnuk, A., Wójtowicz, A. K. Experimental models to study the functions of the blood-brain barrier. Bioengineering. 10 (5), 519 (2023).
- McCloskey, M. C., et al. The Modular µSiM: A mass produced, rapidly assembled, and reconfigurable platform for the study of barrier tissue models in vitro. Advanced Healthcare Materials. 11 (18), 2200804 (2022).
- Mansouri, M., et al. The modular µsim reconfigured: integration of microfluidic capabilities to study in vitro barrier tissue models under flow. Advanced Healthcare Materials. 11 (21), 2200802 (2022).
- Hudecz, D., et al. Modelling a human blood-brain barrier co-culture using an ultrathin silicon nitride membrane-based microfluidic device. International Journal of Molecular Sciences. 24 (6), 5624 (2023).
- Joshi, I. M., et al. Microengineering 3D Collagen Matrices with Tumor-Mimetic Gradients in Fiber Alignment. bioRxiv. , (2023).
- Hsu, M. C., et al. A miniaturized 3D printed pressure regulator (µPR) for microfluidic cell culture applications. Scientific Reports. 12 (1), 10769 (2022).
- Rogers, M. T., et al. A high-throughput microfluidic bilayer co-culture platform to study endothelial-pericyte interactions. Scientific reports. 11 (1), 12225 (2021).
- Wettschureck, N., Strilic, B., Offermanns, S. Passing the vascular barrier: endothelial signaling processes controlling extravasation. Physiological Reviews. 99 (3), 1467-1525 (2019).
- Wang, Y. I., Shuler, M. L. UniChip enables long-term recirculating unidirectional perfusion with gravity-driven flow for microphysiological systems. Lab on a Chip. 18 (17), 2563-2574 (2018).
- Nayak, L., Lin, Z., Jain, M. K. 34;Go with the flow": how Krüppel-like factor 2 regulates the vasoprotective effects of shear stress. Antioxidants & Redox Signaling. 15 (5), 1449-1461 (2011).
- Satoh, T., et al. A pneumatic pressure-driven multi-throughput microfluidic circulation culture system. Lab on a chip. 16 (12), 2339-2348 (2016).
- Abhyankar, V. V., Wu, M., Koh, C. Y., Hatch, A. V. A Reversibly sealed, easy access, modular (seam) microfluidic architecture to establish in vitro tissue interfaces. PLOS ONE. 11 (5), e0156341 (2016).
- Ahmed, A., et al. Local extensional flows promote long-range fiber alignment in 3D collagen hydrogels. Biofabrication. 14 (3), 035019 (2022).
- Hasan, M. R., et al. One-step fabrication of flexible nanotextured PDMS as a substrate for selective cell capture. Biomedical Physics & Engineering Express. 4 (2), 025015 (2018).
- Ahmed, A., et al. Microengineering 3D collagen hydrogels with long-range fiber alignment. Journal of Visualized Experiments. 187, e64457 (2022).
