Metagenomic 도서관 대규모 화면
Abstract
이전 경작하지 않고 미생물의 게놈 시퀀스의 연속 Metagenomic 라이브러리 아카이브 큰 조각. metagenomic 라이브러리를 생성하고 검사를위한 간소화된 절차를 생성하는 것은 미개한 미생물 assemblages의 유전과 신진 대사 특성에 효율적으로 높은 처리량을 수사 따라서 유용합니다. 여기, 주요 프로토콜은 우리가 정확하게 교대 로봇 계측과 (인간) 수동 개입에 따라 긴 프로세스를 설명하기위한 가장 유용한 형식입니다 제안 비디오에 제공됩니다. 첫째, 우리는 스물네 384 자 도서관 접시에서 중복 식민지를 포함할 수 있습니다 각각의 고밀도 macroarray의 점막에 라이브러리 클론을 지점으로 로봇을 고용. 자동화는 또한 매우 치밀한 공간 준비로 도서관 클론의 다수에 맞게 필요한 규모의 소형화에 의해뿐만 아니라 정확성과 속도에 대해이 절차를 위해 필수적입니다,하지만. 일단 생성, 우리는 다음 macroarray의 점막이 프로브 라벨, 멤브레인 하이브리드화, 및 신호 감지를위한 표준 프로토콜의 수정된 버전을 사용하여 관심있는 유전자에 대한 검사를 할 수있는 방법을 보여주었다. 우리는 비디오와 함께 온라인으로 제공되는 모든하는 상세한 서면 관련된 단계에 대한 설명과 필요한 자료와 절차의 시각 데모를 보완.
Protocol
Discussion
스트립 절차는 최적화되지 않았습니다. 그러나, 제조 업체의 지침 (2 세척 각각 100 % 에탄올에 10 분, 60 ° C 0.5 %의 SDS 1 H 1 씻어)에 주어진 스트립 절차가 부족합니다. 100 % 에탄올에 적어도 하룻밤 배양은 ECF의 반응 생성물을 분해하는 데 필요한, 100 % 에탄올에 며칠 보육은 막을 reprobe 수있는 능력에 아무런 악영향이없는 것으로 나타납니다. 제조 업체의 SDS 치료도 부족 것으로 보인다. NUF 80 1 H를 시도했다 ° C 0…
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| AlkPhos Direct Labelling Reagents | kit | Amersham | RPN3680 | Contains labeling reagent, cross-linker solution, reaction buffer, water, control DNA, hybridization buffer, blocking reagent. Store hybridization buffer and blocking reagent at room temperature, other reagents at 2-8°C. |
| ECF Substrate | kit | Amersham | RPN3685 | Contains ECF substrate, ECF substrate dilution buffer. Note: Pack contains total 60 ml reagent; aliquot into 10 ml samples in Falcon tube and store at 20°C. Use about 10 ml per membrane (size of 22 by 22 cm). |
| 20x Secondary Wash Buffer | buffer | 121 g Tris (final 1 M), 117 g NaCl (final 2 M). Adjust pH to 10. Adjust to 1 L with water. Store at 2-8°C for up to 4 months. | ||
| 0.5 M NaH2PO4 buffer pH 7 | buffer | 69 g NaH2PO4.H2O. Adjust pH to 7 with NaOH. Adjust to 1 L with water. Store at room temperature. | ||
| 1 M MgCl2 | 50.8 g MgCl2.6H2O Adjust to 250 ml with water. Store at room temperature. | |||
| 10% (w/v) SDS | 20 g SDS Adjust to 200 ml with water. Store at room temperatur |
