Method Article

트렌스 제닉 생산 Xenopus laevis 제한 효소 중재 통합 및 핵 이식에 의해

DOI:

10.3791/2010

⸱

August 21st, 2010

 , 
1The Healing Foundation Centre, Faculty of Life Sciences, University of Manchester, 2Department of Developmental Biology, Washington University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 비디오 프로토콜은 유전자 변형을 생성하는 방법을 보여줍니다 Xenopus laevis unfertilized 계란으로 핵 이식 뒤에 정자 핵에 transgenes의 소개로.

Abstract

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Xenopus 게놈에 복제된 유전자 제품의 안정적인 통합은 배아 발달의 나중 단계에서 유전자를 표현하고, 그때와 발기인은 배아 내에서 유전자 발현을 조절하는 방법 정의, 표현의 시간과 장소를 제어하는 것이 필요합니다. 프로토콜 여기서 보여주는 효율적으로 유전자 변형 Xenopus laevis의 배아를 생산하는 데 사용할 수 있습니다. 1 :이 transgenesis 방식은 세 부분을 포함한다. 정자의 핵은 성인 X.으로부터 격리 아르 정자 플라즈마 막을 permeabilizes lysolecithin와 치료에 의해 ​​laevis의 testis. 2. 에그 추출물은 저속 원심 분리, 세포주기의 계면으로 진행하기 위해 추출을 일으킬뿐만 아니라 칼슘과 계면 cytosol를 분리하기 위해 고속 원심 분리에 의해 준비가되어 있습니다. 3. 핵 이식 : 핵 및 추출물은 transgene 및 제한 효소의 작은 금액으로 소개하는 선형 플라스미드 DNA와 결합하고 있습니다. 짧은 반응 동안, 달걀 추출물은 부분적으로 정자 염색질을 decondenses하고 제한 효소는 게놈에 transgene의 재조합을 촉진 염색체 휴식을 생성합니다. 취급 정자 핵은 다음 unfertilized 계란으로 이식하고 있습니다. transgene의 통합은 일반적으로 이전 결과 배아는 키메라하지 않는 등 처음 배아 절단을 발생합니다. 이 배아는 발기인 및 유전자 기능 분석을위한 유전자 변형 배아의 효과적이고 신속한 세대 수 있도록, 다음 세대 번식을 필요로하지 않고 분석할 수 있습니다. 성인 X. 이 절차로 인한 laevis 또한 germline 통해 transgene을 전파하고 여러 목적을 위해 유전자 변형 동물의 라인을 생성하는 데 사용할 수 있습니다.

Protocol

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이 transgenesis 접근 방식의 수정된 버전은 초기에 1과 2에서 설명한되었습니다.

A.의 정자 핵 준비

이 핵 준비 방법은 머레이 3에서 적응이지만, 그들이 정자 핵 이식과 계란의 후속 개발과 방해로 프로 테아제 억제제가 생략되었습니다. Aliquots는 -80 ° C에서 냉동하고 약 6 개월 동안 transplantations 사용할 수 있습니다.

모든 솔루션은 준비 사전 준비를 처음으로 얼음에 배치해야합니다.

  1. 1-2 성인 남성이 X를 마취 최소한 20 분 Tricaine의 침수에 의해 laevis는 pithing 다음, testes를 제거합니다.
  2. , 혈액, 혈관과 지방 시신을 제거 1XMMR를 포함하는 60mm 페트리 접시에 잠시 그​​들을 씻고, 그리고 지방 신체의 추가 조각을 제거하기 위해 종이 타월에 testes를 롤. 이것은 정자를 출시 등 소중히 testes를 안됩니다.
  3. 눈에 띄는 덩어리가 없을 때까지 건조 60 mm 페트리 접시와 포셉와 더운 물에 담가서 부드럽게 testes에 testes....

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Discussion

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각 형질 구성을 테스트하기 위해서, 우리는 일반적으로 500-1000 계란으로 핵 이식,이 규모에서, 우리는 알을 낳기 위해 유도 얼마나 많은 암컷에 따라 하루에 10 가지 다른 구조까지 표현 형질 배아를 생성할 수 있습니다. 이러한 transplantations의 계란 클리브 중 하나에 대한 세 번째이 cleaving 배아의 60~80%가 정상적으로 gastrulation을 통해 진행합니다. 이 배아의 10-50% 사이에 사용하는 반응 조건에 따라하는 것이 관심의 transgene을 표현. 한 노동자가 하루에 여러 plasmids의 숫자를 표현하는 유전자 변형 배아의 인구를 만들 수 있도록 그러므로, 일단이 절차가 실험실에서 설립, 그것이 가능합니다. Transgenes가 concatemer (5-35 부)으로 게놈에 통합이 방법은 또한 높은 주파수 (80~90%) 4에서 단일 배아의 게놈에 하나 이상의 다른 transgene을 cointegrate하는 데 사용할 수 있도록.

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Disclosures

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동물 실험 동물 관리에 의해 명시된 지침과 규정에 따라 수행과 의과 워싱턴 대학 학교위원회를 사용했다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리의 작업에 대한 자금은 NIH, 천의 월, 및 미국 암 협회에 의해 제공됩니다.

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Materials

A.의 정자 핵 준비

시약 :

  1. 1X MMR (2mM CaCl 2, 5mM HEPES, pH7.5, 2mM KCl, 1mM MgCl 2, 100mM NaCl).
  2. 0.1 % Tricaine Methanesulfonate (MS222, 아미노 벤 초산 에틸 에스테르, 시그마 A - 5040), 0.1 %의 나트륨 중탄산염. 물에 용해.
  3. 2X 원자력 준비 버터 (NPB). 정자의 핵 준비 당일, 냉동 보관 주식 솔루션 aliquots에서 2X NPB 30 ML을 만들어 : 500 MM의 자당 (1.5 M 재고), 30 MM HEPES (1M 주식, 코로 적정하다 그 산도 7.7이있는 그래서 15 ㎜), 1 ㎜의 spermidine의 trihydrochloride (시그마 S - 2501, 10 MM 재고), 0.4 MM spermine의 tetrahydrochloride (시그마 S - 1141, 10 MM 재고), 2 MM dithiothreitol (시그마 D - 0632, 100 MM 재고), 2 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (500 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 산도 8.0).
  4. A. 만드는 2XNPB를 사용하여 30ml 1X NPB, B. 10ml 1XNPB 3퍼센트 BSA (분수 V, 시그마 A - 7906), C. 5ml 1XNPB 0.3 %의 BSA.
  5. Lysolecithin : 10 MG / ML L - α - 리소 - 레시틴, 계란 노른자 (Calbiochem, 440,154) 100 μl은, 그냥 사용하기 전에 실온에서 디졸브. 20 스토어 확실한 재고 ° C. 그것이 끈적이된다면 주식 가루를 폐기하십시오.
  6. 소 혈청 알부민 (BSA) : 10 % (W / V) BSA는 (분수 V, 시그마 A - 7906) 정자의 핵 준비 당일 물 5 ML을 확인합니다.
  7. 정자 저장 버퍼 (1ml) 1X NPB, 30 % 글리세롤, 0.3 % BSA.
  8. 정자 희석 버퍼 : 250 MM의 자당 75 MM KCl, 0.5 당연 spermidine의 trihydrochloride 0.2 MM spermine의 tetrahydrochloride. 20 산도 7.3-7.5하고 저장 0.5-1 ML의 aliquots로 적정하다 ° C.
  9. Hoechst 번호 33342 (시그마 B - 2261) : DH 2 O 10 MG / ML 주식, 20 가벼운 꽉 용기에 저장 ° C.

장비 :

  • 스윙잉 버킷 로터와 원심 분리기
  • 일종의 투박한 무명
  • 해부 도구 (집게와 가위)
  • 형광 현미경
  • 깔때기
  • 장갑
  • hemocytometer
  • 바늘 (26 게이지)
  • 종이 타올
  • 배양 접시 (60 ㎜)
  • pipettes
  • 플라스틱 (5 및 10 ML)
  • Pipetman 팁 (1 ML 및 200μl)
  • 주사기 (1 ML)
  • 튜브 (14 ML, 팔콘, 2059)
  • 튜브
  • microcentrifuge (1.5 ML)

고속 추출의 B. 준비

시약 :

  1. 1X 마크의 수정 링어 (MMR) : 100 MM NaCl, 2 MM KCl, 1 MgCl MM 2, 2 MM CaCl 2, 5 MM HEPES, pH를 7.5. 10X 재고를 준비하고, NaOH와 7.5 산도를 조정합니다.
  2. 20X 추출 버퍼 (XB) 소금 재고 : 2 M KCl, 20 MM MgCl 2, 2 MM CaCl 2, 필터 소독 4 및 저장 ° C.
  3. 필터 소독하고, aliquots에 저장, 15 mm까지 희석하면 있도록 산도는 7.7이다 코와 titrated 1X XB 소금, 50 MM의 자당, 10mM의 HEPES (1 M 재고,; 버퍼를 (신선한 얼음에 저장된 XB) 추출 20 ° C). 100 ML에 대한 준비.
  4. 2퍼센트 (W / V) 1 - L - 시스테인 수화물 하이드로 클로라이드는 사용하기 전에 1X XB 소금에 만들어 NaOH로 pH의 7.8에 titrated. 300 ML에 대한 준비.
  5. CSF - XB : 1X XB 소금, 1 MM MgCl 2 (XB 소금 2 선물을 MgCl 이외에, 최종 농도 2 ㎜), 10 MM의 HEPES, 산도 7.7, 50 MM의 자당, 5 MM EGTA, pH를 7.7. 50 ML을 준비합니다.
  6. 단백 분해 효소 억제제 : 류펩틴, chymostatin 및 pepstatin, 10 디메틸 sulfoxide (DMSO)에 MG / ML의 최종 농도로 녹아 각각의 혼합. 20 작은 aliquots에 저장 ° C.
  7. 1 M CaCl 2.
  8. 에너지 믹스 : 150 MM의 크레아틴 인산, 20 MM ATP, 20 MM MgCl 2.
  9. 임산부 마레 세럼 생식 샘 자극 호르몬 (PMSG) : 100 U / ML PMSG (PG600 ®, 인터 ​​베트 (주), 021825). 물에 용해하고 20 ° C.에 저장된
  10. 인간 Chorionic 생식 샘 자극 호르몬 (HCG) : (CHORULON ®, 인터 ​​베트 (주), 057,176) 1,000 U / ML HCG. 물에 용해 4 ° C.에 저장된

장비 :

  • Xenopus laevis 여성
  • 바늘 (18, 26 게이지)
  • 파스퇴르 피펫
  • 넓은 구멍
  • 주사기 (1 ML)
  • 튜브, microcentrifuge (0.5 ML)
  • 튜브, 두꺼운 벽 폴리 카보 네이트 (베크 349622)
  • 튜브, ultraclear (14 X 95mm, 베크만, 344,060)
  • 초원 심 분리기 및 로터 (예, 로터 SW 40 티 및 TLA - 100.3로 베크맨 TL - 100)
  • 계란 수집 비커
  • 버킷 또는 여성 개구리 (예 : 메쉬 뚜껑 4 개, L, 플라스틱 비커) 개최를위한 용기.

C. 핵 이식.

시약 :

  1. 0.1XMMR에서 2.5 % 아가로 오스 (사출 요리를 만들기위한)
  2. 1XMMR에서 2.5 %의 시스테인사용 당일 준비 pH8.0,
  3. Ficoll
  4. 10 MG / ML gentamycin (1000X 주식)
  5. 고속 계란 추출물 (위 참조)
  6. 100 MgCl 2
  7. 10X MMR (위 참조)
  8. 제한 효소 (뉴잉글랜드 Biolabs에서 예 노티)
  9. 정자 희석 버퍼 (SDB, 위 참조)와 정자의 핵은 (위 참조)
  10. 인간 Chorionic 생식 샘 자극 호르몬 (HCG) 위와 같이
  11. 미네랄 오일 (시그마, M8410)
  12. transgene로 소개하는 플라스미드 선형 :의 농도에 선형 플라스미드 준비 약 100 무균의 NG / μl, nuclease없는 물 (우리가 트리스와 태아에게 어느 정도 독성이 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) -이 포함된 버퍼를 피하기). 플라스미드를 linearize하는 데 사용되는 제한 효소는 핵 이동 반응에 사용되는 것과 동일하게 할 필요는 없습니다. 우리는 보통 관계로 선형이다 플라스미드 무엇, 모든 반응에 대한 노티를 사용합니다. 반응에 사용되는 효소 희석의 일부 교정이 필요할 수 있습니다 같은 너무 많은 효소가 이후 gastrula 개발에 악영향을 일으킬 수 있습니다. 플라스미드는 여러 가지 방법으로 정화 수있다 : 우리는 일반적으로 제조 업체의 지시에 따라 Qiagen PCR Qiaquick 정화 키트를 사용하여, 젤에서 단일 밴드의 정화가 필요하지 않습니다. 플라스미드면하는 것은 페놀 / 클로로포름 extractions 및 에탄올 석출, 유기물 및 에탄올의 모든 흔적을 제거하는 특정 수를 사용하여 정화됩니다.

장비 :

주사 아가로 오스 요리 : 60mm 플라스틱 배양 접시에있는, 작은 35mmX35mm은 달걀로 작성을위한 아가로 오스 - 코팅 바닥과 우울증을 만드는 물 0.1XMMR에서 용융 2.5 % 아가로 오스에 보트를 무게하다. 4 일단 아가로 오스가 가득 찼어, parafilm에 싸서 보관 ° C까지 사용. 당신이 할 계획이 각 유전자 변형 반응에 대해 사전에 2-3 요리를합니다.

주입 펌프 : 우리는 미네랄 오일로 가득 3 CC 주사기 / 바늘을 갖춘 하버드 장치에서 하나의 주사기 주입 펌프를, (시그마 M - 8410)을 사용합니다. 주사기 바늘 팁 (튜빙을 perforating에서 계속) 블런트와 미세 tygon 튜빙을 연결합니다. ~ 10nl/sec에서 펌프를 실행, 이것은 바늘 각 계란에 시간이 더 이상 1 초 수 없습니다 것으로 가정합니다. 펌프 전에 주사기를위한 플런저는 튜브가 발생 밖으로 피스톤과 오일의 지속적인 긍정적인 흐름을 잔뜩 것을 보증하기 위해 하루 시작 transgenesis 몇 분 동안 미리 실행되어야합니다.

핵 전송을위한 바늘. micropipette의 풀러를 사용하여 길이, 경사 도움말 바늘을 생성합니다. beveled 모양 ~ 80 미크론의 열기를 얻기 위해 눈 마이크로 미터가 장착된 해부 현미경 forcep과 함께 이것을 클립.

기타 설비 : Xenopus laevis 여성, stereomicroscope, 보육, micromanipulator, microinjection 니들 풀러 (예 : 모델 P - 87, 셔터), 주사기 바늘 (26 게이지), 유리 microinjection의 바늘, 80μm 직경 microinjection 니들 팁 보정 클리핑을위한 눈의 마이크로 미터, 배양 접시는 보트 35mm, Tygon 튜빙을 (ID = 32분의 1 최후 통첩 OD = 3 / 32인치) 무게

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kroll, K. L., Amaya, E. Transgenic Xenopus embryos from sperm nuclear transplantations reveal FGF signaling requirements during gastrulation. Development. 122, 3173-3183 (1996).
  2. Amaya, E., Kroll, K. L. A method for generating transgenic frog embryos.<....

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Xenopus laevisSperm Nuclei IsolationEgg Extract PreparationNuclear TransplantationRestriction Enzyme IntegrationTransgenic Embryo ProductionCytosolic Fraction IsolationCytostatic Factor InactivationEmbryo MicroinjectionPromoter Function Analysis

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