Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Måling af Poly A halelængde fra Drosophila larve hjerne og cellelinje

Published: January 12, 2024 doi: 10.3791/66116
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biology, University of Nevada, Reno

Summary

Protokollen beskriver en effektiv og pålidelig metode til kvantificering af poly(A)-længden af det interessante gen fra Drosophila-nervesystemet , som let kan tilpasses væv eller celletyper fra andre arter.

Abstract

Polyadenylering er en afgørende posttranskriptionel modifikation, der tilføjer poly (A) haler til 3'-enden af mRNA-molekyler. Længden af poly (A) halen er tæt reguleret af cellulære processer. Dysregulering af mRNA-polyadenylering har været forbundet med unormal genekspression og forskellige sygdomme, herunder kræft, neurologiske lidelser og udviklingsabnormiteter. Derfor er forståelse af dynamikken i polyadenylering afgørende for at afsløre kompleksiteten af mRNA-behandling og posttranskriptionel genregulering.

Dette papir præsenterer en metode til måling af poly (A) halelængder i RNA-prøver isoleret fra Drosophila-larvehjerner og Drosophila Schneider S2-celler. Vi anvendte guanosin / inosin (G / I) tailing tilgang, som involverer enzymatisk tilsætning af G / I-rester i 3'-enden af mRNA ved anvendelse af gærpoly (A) polymerase. Denne modifikation beskytter RNA's 3'-ende mod enzymatisk nedbrydning. De beskyttede poly(A)-haler i fuld længde transskriberes derefter omvendt ved hjælp af en universel antisenseprimer. Derefter udføres PCR-amplifikation ved anvendelse af en genspecifik oligo, der er målrettet mod genet af interesse, sammen med en universel sekvensoligo, der anvendes til revers transkription.

Dette genererer PCR-produkter, der omfatter poly (A) halerne af genet af interesse. Da polyadenylering ikke er en ensartet modifikation og resulterer i haler af varierende længde, viser PCR-produkterne en række størrelser, hvilket fører til et udtværingsmønster på agarosegel. Endelig udsættes PCR-produkterne for kapillærgelelektroforese med høj opløsning efterfulgt af kvantificering ved hjælp af størrelserne på poly(A) PCR-produkterne og det genspecifikke PCR-produkt. Denne teknik tilbyder et ligetil og pålideligt værktøj til analyse af poly (A) halelængder, så vi kan få dybere indsigt i de indviklede mekanismer, der styrer mRNA-regulering.

Introduction

De fleste eukaryote mRNA'er er posttranskriptionelt polyadenylerede ved deres 3′ endestation i kernen ved tilsætning af ikke-skabelonerede adenosiner af kanoniske poly(A) polymeraser. En intakt poly(A)-hale er afgørende i hele mRNA's livscyklus, da den er afgørende for mRNA-nuklear eksport1, letter interaktion med poly(A)-bindende proteiner for at forbedre translationel effektivitet2 og giver resistens mod nedbrydning3. I visse tilfælde kan poly (A) halen også gennemgå forlængelse i cytoplasmaet, lettet af ikke-kanoniske poly (A) polymeraser4. I cytoplasma ændres poly (A) halelængde dynamisk og påvirker levetiden for mRNA-molekylet. Talrige polymeraser og deadenylaser er kendt for modulerende halelængde 5,6,7. For eksempel korrelerer forkortelsen af poly(A)haler med translationel undertrykkelse, mens forlængelsen af poly(A)haler forbedrer oversættelsen 8,9.

Akkumulering af genomiske undersøgelser har vist den grundlæggende betydning af poly (A) halelængden på tværs af forskellige facetter af eukaryot biologi. Dette omfatter roller i kimcelleudvikling, tidlig embryonal udvikling, neuronal synaptisk plasticitet til læring og hukommelse og det inflammatoriske respons10. Der er udviklet adskillige metoder og analyser til måling af poly(A) halelængder. For eksempel udnytter RNase H/oligo(dT)-analysen RNase H i nærvær eller fravær af oligo(dT) til at studere poly(A) halelængde11,12. Andre metoder til undersøgelse af poly(A)hale omfatter PCR-amplifikation af 3'-ender, såsom hurtig amplifikation af cDNA-ender, poly(A)-test (RACE-PAT)12,13 og ligasemedieret poly(A)-test (LM-PAT)14. Yderligere modifikationer af PAT-analysen omfatter ePAT15 og sPAT16. Enzymatisk G-tailing17,18 eller G/I-tailing af 3'-enden er andre variationer af PAT-assayet. Yderligere modifikation af disse teknikker omfatter anvendelse af fluorescerende mærkede primere sammen med kapillærgelelektroforese til højopløsningsanalyse, benævnt højopløsningspoly(A)-testen (Hire-PAT)19. Disse PCR-drevne assays muliggør hurtig og højfølsom poly(A) længdekvantificering.

Med udviklingen af næste generations sekventering tillader en high-throughput sekventeringsmetode, såsom PAL-seq20 og TAIL-seq21, polyadenyleringsanalyser i transkriptom-bred skala. Disse metoder tilvejebringer imidlertid kun korte sekventeringslæsninger af 36-51 nukleotider. Derfor blev FLAM-Seq22 udviklet til global halelængdeprofilering af mRNA i fuld længde og giver lange aflæsninger. Nanopore-teknologi23 giver PCR-uafhængig, direkte RNA eller direkte cDNA-sekventering til poly(A) halelængdeestimater. Disse metoder med høj kapacitet er dog ikke uden begrænsninger. De kræver store mængder udgangsmaterialer, er dyre og tidskrævende. Desuden kan analyse af sjældne transkripter være ekstremt udfordrende med metoder med høj kapacitet, og PCR-baserede metoder med lav gennemstrømning giver stadig en fordel, når et lille antal transkripter skal analyseres til pilotforsøg og validering af andre metoder.

Vi har for nylig demonstreret, at Dscam1 mRNA'er indeholder korte poly(A)-haler i Drosophila, hvilket nødvendiggør en ikke-kanonisk binding af det cytoplasmatiske poly(A)-bindende protein på Dscam1 3'UTR ved hjælp af G/I-tailing-metoden24. Her giver vi en strømlinet procedure til vævsforberedelse og kvantificering af poly (A) længde af mRNA'er fra Drosophila-nervesystemet og Drosophila S2-celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Opdræt og udvælgelse af Drosophila-larver

  1. Opret/dyrk fluestammen (w1118, vildtype) på standardfluefodermedium ved 25 °C i en befugtet inkubator.
  2. Vælg 10 vandrende 3rd instar larver 72 timer efter æglægning.
  3. Læg larverne i et 35 mm tomt petrifad og vask dem forsigtigt ved at overføre larverne til det nye fad med postevand med pincet. Gør dette 2x for at fjerne eventuel resterende mad.

2. Hjerneisolering fra Drosophila larver (figur 1)

Figure 1
Figur 1: Dissektion af Drosophila larvehjerne fra 3. instar vandrende stadium. (A) Skematiske tegninger af Drosophila larve. (B-G) Larve dissektion. Klik her for at se en større version af denne figur.

  1. Placer 10 larver på et dissektionsfad indeholdende iskold PBS.
  2. Placer larven dorsal side op (identificeret ved trakealrør, der løber langs dens længde) og fastgør hver ende til bunden af skålen efterfulgt af at lave et lille snit på kropsvæggen i den bageste ende.
  3. Skær kropsvæggen langs den dorsale midterlinje mod den forreste ende ved hjælp af mikrodissektionssaks.
  4. Skyl kortvarigt det indre af larven ved hjælp af en Pasteur-pipette 3x med PBS i skålen for at udsætte hjernen.
  5. Find og løft hjernen ved hjælp af tangen og isoler den forsigtigt ved hjælp af mikrodissektionssaks.
  6. Overfør de dissekerede hjerner til et 1,5 ml mikrocentrifugerør fyldt med iskold PBS på is; Saml alle larvehjerner. Der fortsættes med RNA-ekstraktion ved hjælp af et RNA-mikroprep-kit som beskrevet i afsnit 4.
    BEMÆRK: Foretag en dissektion af 10 larver inden for 15 minutter for at forhindre vævsskade og RNA-nedbrydning.

3. Drosophila S2 Schneider celler

  1. Drosophila S2-celler dyrkes i Drosophila Schneiders medium suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) ved 25 °C i en befugtet inkubator til en densitet på 8 × 10,6 til 10 × 106 celler/ml med mindst 90% levedygtighed.
  2. I et 50 ml sterilt konisk rør fortyndes cellerne til 2,5 × 106 celler/ml med Schneiders Drosophila-medium suppleret med 10 % FBS, der er forvarmet til 25 °C.
  3. 8 ml af cellesuspensionen (20 × 106 celler) overføres til en 100 mm dyrkningsplade, og der tilsættes 4 ml substrat for at nå op på 12 ml (dag 1).
  4. De dyrkede celler inkuberes ved 25 °C i en befugtet inkubator.
    BEMÆRK: Celler klæber løst til pladen efter 12-16 timer (dag 2).
  5. Cellerne transfekteres med passende DNA-plasmider24.
  6. Inkuber i 48 timer i en befugtet inkubator.
  7. Efter inkubation indsamles celler ved tilsætning af 5 ml iskold PBS ved forsigtig pipettering (dag 4).
  8. Overfør cellerne til et 15 ml rør.
  9. Pillecellerne centrifugeres ved 1.000 × g i 5 minutter ved 4 °C.
  10. Cellerne skylles 2x med iskold PBS ved forsigtig pipettering og opsamles cellerne ved centrifugering ved 1.000 × g i 5 minutter ved 4 °C.
  11. Udfør RNA-ekstraktion ved hjælp af et RNA miniprep-sæt.
    BEMÆRK: Udfør følgende trin inde i en steril laminar flowhætte.

4. Total RNA-ekstraktion fra Drosophila-larver, hjerne og S2-celler

  1. Larvehjerne: PBS fjernes ved kort centrifugering (8 s kort centrifugering ved 5.000 × g).
  2. Tilsæt 600 μL RNA-lysebuffer og homogeniser 10x med en plastpistil. Undersøg røret visuelt under et stereomikroskop for at sikre fuldstændig lysis.
  3. Der centrifugeres ved 1.000 × g i 5 minutter ved 4 °C for at fjerne vævsrester. Den rensede supernatant overføres til et nukleasefrit mikrocentrifugeglas.
  4. Isoler RNA ved hjælp af et RNA-mikroprep-sæt i henhold til producentens anvisninger.
    BEMÆRK: Brugen af et RNA-mikroprep-kit er afgørende for larvehjerneprøverne på grund af den lille mængde RNA, der er til stede i prøverne.
  5. S2-celler: Fjern PBS og isoler RNA i henhold til producentens anvisninger.
  6. Mål RNA-udbytte og kvalitet ved spektrofotometri og agarosegelelektroforese.
    1. Renheden og mængden af ekstraheret RNA bestemmes ved at måle den optiske densitet af det ekstraherede RNA ved henholdsvis A260 nm og A280 nm. Sørg for, at forholdet A260 nm/A280 nm er ≥2,0, og at RNA-koncentrationen er >350 ng/μL til downstream-applikationer.
      BEMÆRK: Et typisk RNA-udbytte fra 10 Drosophila-larvehjerner er ~500-800 ng/μL eller 2,5-4 μg i 5 μL. For S2-celler er udbyttet ~ 2-3 μg / μL (15-30 μg i 15 μL). Isoleret RNA kan opbevares ved -80 °C til langtidsopbevaring.

5. Fremstilling af RNA-gel og elektroforese

  1. 1,5% Denaturerende RNA gel (100 ml)
    BEMÆRK: Formaldehyd er giftigt gennem hudkontakt og indånding af dampe; Håndter det i en kemisk stinkhætte.
    1. Tre agarosetabletter (1,5 g) opløses i 82 ml MOPS-buffer (supplerende fil 1), indtil tabletterne brydes helt op og danner fine partikler.
    2. Opvarm agaroseopslæmningen i en mikrobølgeovn, indtil opløsningen er klar, og alle partikler er helt opløst.
    3. Opløsningen afkøles til ~60 °C.
    4. Tilsæt 18 ml 37% formaldehyd, bland derefter ved forsigtig hvirvling. Hæld opløsningen i støbebakken og lad den størkne i en stinkhætte.
  2. Forberedelse af RNA-prøver og elektroforese
    1. RNA-prøven fortyndes til 200 ng (i 5 μL) og tilsættes 5 μL 2x RNA-belastningsfarvestof.
    2. Prøverne opvarmes til 70 °C i 5 minutter i et tørt bad.
    3. Indlæs 2 μL RNA-stige i den første bane og 10 μL prøver i de tilstødende baner.
    4. Udfør elektroforese i MOPS-buffer ved 100 V i 60 minutter for en 5 x 6 cm gel.
      BEMÆRK: Juster elektroforeseforholdene afhængigt af amplikonstørrelserne.
    5. Visualiser gelen på en UV-transilluminator.
      BEMÆRK: Tilstedeværelsen af et enkelt bånd ~ 600 nukleotidstørrelse indikerer intakt RNA-præparat (se figur 2A).

6. Poly(A) måling af halelængde

Figure 2
Figur 2: Forberedelse af RNA-prøver og poly(A)-hale-assayet. (A) RNA-gelbillederne viser total RNA fra Drosophila-larvehjernen (venstre) og S2-cellerne (højre) på en 1,5% formaldehydagarosegel. Enkeltstrengede RNA-stigestørrelser er vist i nukleotider på bane M. Bemærk en større RNA-banding ved ~ 600 nt, som er fra rRNA. (B) Skemaer over poly(A)-haleassay. Forkortelse: G/I = guanosin/inosin. Klik her for at se en større version af denne figur.

  1. GI-tailing (figur 2B)
    1. Ved at holde reagenserne på is fremstilles følgende blanding (20 μL): op til 14 μL total RNA-prøve (1 μg), 4 μL 5x halebufferblanding og 2 μL 10x haleenzymblanding.
    2. Inkuber ved 37 °C i 60 minutter i en termocyklist.
    3. Tilsæt 1,5 μL af halestopopløsningen; Hold på is i 2 min.
      BEMÆRK: Fortsæt med omvendt transkription eller opbevar GI-tailed RNA-prøverne ved -80 °C, indtil de er klar til at fortsætte til revers transkription.
  2. Omvendt transkription og PCR-forstærkning
    1. Syntetiser cDNA ved at forberede blandingen og inkubere den under de betingelser, der er beskrevet i supplerende fil 1.
    2. Fortynd cDNA-prøverne og udfør PCR for at amplificere DNA som angivet i supplerende fil 1.

7. PCR-produktanalyse ved agarosegelelektroforese

  1. Analyser en lille del (2-5 μL) af PCR-produkterne fra trin 6.2.2 på en 2,5% agarosegel ved elektroforese ved 100 V i 45 minutter til kvalitetskontrol.
  2. Kontroller specificiteten af PCR for genspecifikke og halespecifikke reaktioner ved at sekventere de gelekstraherede PCR-bånd.

8. Kapillær elektroforese

  1. Udfør gelelektroforese med høj opløsning på 1 μL PCR-produkter (0,5-5 ng/μL) fra genspecifik og poly(A)-specifik PCR ved hjælp af bioanalysatoren med et højfølsomt DNA-sæt. Se efter velløste toppe, der indikerer et vellykket løb.

9. Dataanalyse: måling af halelængde af poly(A) (figur 3)

Figure 3
Figur 3: Poly(A) halelængde og topværdimåling. Klik her for at se en større version af denne figur.

  1. Adgang til data
    1. For at få adgang til dataene skal du åbne xad-filen i softwaren.
    2. Vælg eksempelnavnet eller stigen i trævisningspanelet.
      BEMÆRK: Dette viser resultatet som elektroferogrammer eller gellignende billeder for de valgte prøver. Den nederste markør 35 basepar (bp) og den øverste markør 10.380 bp er de interne standarder, der bruges til at justere stigedataene (50-7.000 bp) med data fra prøvebrøndene.
    3. Zoom ind og ud af elektroferogrammerne og gellignende billeder for at få vist detaljerne.
  2. Udførelse af top- og udtværingsanalyse
    1. For at opnå topstørrelserne skal du åbne elektroferogrammet for en valgt prøve.
    2. Højreklik på elektroferogrammet, og vælg manuel integration for manuelt at vælge toppe ved at trække den vandrette linje.
    3. Overhold topværdierne i tabellen Top. Identificer toppen med den største tophøjde. Dette er en top af poly (A) halelængde for en individuel prøve. I det viste eksempel er det 346 bp.
    4. Aktivér ikonet Vis / skjul sætpunkter i topmenuen, og vent på, at et nyt panel dukker op på højre side.
    5. Vælg Avanceret, rul ned for at finde Udfør udtværingsanalyse, og markér afkrydsningsfeltet. Dette tilføjer tabellen Region til fanen elektroferogrammet.
    6. Vælg et elektroferogrammer fra en prøve, og gå til tabellen Region, som viser menuen Fra [bp] og Til [bp]. For at indstille start og slutning [bp] skal du højreklikke på elektroferogrammet og vælge Region for at tilføje Tilføj region.
    7. Højreklik på en hvilken som helst celle i tabellen Region , og vælg Rediger regioner for at få et lille nyt vindue til at dukke op, hvor brugerdefinerede regioner kan indstilles.
      BEMÆRK: For eksempel brugte vi et område på 300 bp til 550 bp til GAPDH. Den genspecifikke GAPDH PCR gav et højdepunkt ved 265 bp. Den universelle primer (tabel 1) forlænger længden af poly(A) PCR med 35 bp via udglødning til G/I-tailed RNA'er. Således starter det første adeninnukleotid på GAPDH RNA ved 300 bp (265 + 35). Vi begrænsede vilkårligt den maksimale poly(A) halelængde til 250 (300 + 250 = 550). Fra områdetabellen returnerer programmet den gennemsnitlige størrelse inden for området som 387 bp.
    8. Brug ligning (1) til at beregne poly (A) halelængden på mRNA'et af interesse:
      Poly(A) halelængde = (A - B - 35) (1)
      Hvor A er den gennemsnitlige bp af poly(A)-specifikt PCR-produkt fra elektroferogrammet (dvs. 387 bp for GAPDH), B er toppen bp for genspecifikt PCR-produkt fra elektroferogrammet (dvs. 265 bp for GAPDH), og "35" er længden af universelt omvendt primermærke.
      BEMÆRK: Fra beregningen ovenfor er den gennemsnitlige poly (A) halelængde af GAPDH 387 - 265 - 35 = 87 bp.

10. Visualisering af poly(A) halelængdefordeling

  1. Eksportere data som en csv-fil under Filer | Eksport | Eksempeldata for at hente eksempeldata.
    BEMÆRK: Den eksporterede csv-fil viser kørselstid i stedet for bp på X-aksen.
  2. Gå til et elektroferogrammer af en prøve, og marker Vis størrelser på fanen Elektroferogrammer for automatisk at konvertere regionstabellen på regionstabellen fra bp til kørselstid. I eksemplet svarer 70,39 s til 86,28 s til 300 bp til 550 bp.
  3. Åbn csv-filen, og vælg værdierne fra 70.39 s til 86.28 s kørselstid for at generere en graf. Hvis du vil visualisere bp-størrelser til X-aksen på grafen, skal du eksportere elektroferogrammet med bp-størrelser som en billedfil og overlejre det på grafen, der genereres i regnearket. Dette vil passende matche bp-størrelserne på poly (A) halefordeling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Her analyserede vi poly (A) halelængden af Dscam1 og GAPDH fra Drosophila larvehjerner (figur 4). Isolerede RNA'er blev visualiseret på en agarosegel til kvalitetskontrol. Et enkelt RNA-bånd ved omkring 600 nukleotidstørrelse indikerer intakt RNA-præparat (figur 2A). RNA'er blev udsat for G / I tailing og høj opløsning kapillær elektroforese ved hjælp af en Agilent 2100 bioanalysator. Gelbillederne blev eksporteret ved hjælp af Agilent 2100 Expert Software og samlet i overensstemmelse hermed. PCR-produkterne fra GAPDH og Dscam1 genspecifikke primerpar viste et særskilt enkelt bånd, mens de fra de genspecifikke/universelle primerpar viste forskellige udtværingsmønstre (figur 4A og tabel 1), hvilket indikerer differentiel poly(A) længde af GAPDH og Dscam1 mRNA'er. I figur 4B blev udtværingsanalysen brugt til at opnå gennemsnitlige poly(A) halelængder fra GAPDH og Dscam1. Elektroferogrammerne blev eksporteret og modificeret til at repræsentere poly(A)-halelængderne (figur 4C).

På samme måde udførte vi en poly(A) halelængdeanalyse på S2-celler (figur 5). For at bestemme rollen som Dscam1 3'UTR i forkortelse af poly (A) haler blev S2-celler transfekteret med DNA-plasmiderne indeholdende Dscam1-kodende region med enten SV40 3'UTR eller Dscam1 3'UTR. Minimum SV40 3'UTR blev valgt til kontrol af Dscam1 3'UTR, da SV40 3'UTR er blevet brugt i vid udstrækning som et minimum transkriptionsterminerings- og polyadenyleringssignal for rekombinante DNA-plasmider. Total RNA blev ekstraheret og udsat for RT-PCR, G / I tailing og kapillær elektroforese med høj opløsning (figur 5). Resultatet viser, at poly(A)halelængdefordelingen fra SV40 3'UTR-plasmidet fulgte et lignende mønster som for endogent GAPDH , mens poly(A)halelængdefordelingen fra Dscam1 3'UTR-plasmidet fulgte et lignende mønster som for endogent Dscam1 mRNA fra larvehjernerne.

Figure 4
Figur 4: Poly(A) halelængdemåling af GAPDH og Dscam1 fra larvehjernerne. (A) Kapillærgelelektroforese løser det genspecifikke PCR-produkt som et diskret bånd (første og anden bane) for GAPDH2 og Dscam1. PCR-produktet ved hjælp af universel omvendt primer viser en udtværingsfordeling (tredje og fjerde bane). * Ikke-specifikt bånd. (B) De gennemsnitlige poly(A)-halelængder blev beregnet ved hjælp af udtværingsanalysen. (C) Fordelingen af poly(A)-halelængden blev rekonstrueret ud fra den eksporterede csv-fil. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Poly(A) halelængdemåling af transfekteret Dscam1 DNA-plasmid. Dyrkede Drosophila S2-celler blev co-transfekteret med Dscam1-konstruktionerne, der indeholder kodningsregionen Dscam1 og 3′UTR af enten Dscam1 eller SV40. (A) Kapillærgelelektroforesebilleder vises for det genspecifikke PCR-produkt som et diskret bånd (første og anden bane) for SV40 (Dscam1-SV40 3'UTR) og Dscam1 (Dscam1-Dscam1 3'UTR). PCR-produktet ved hjælp af universel omvendt primer viser et udtværingsmønster (tredje og fjerde bane). * Ikke-specifikt bånd. (B) De gennemsnitlige poly(A)-halelængder blev beregnet ved hjælp af udtværingsanalysen. (C) Poly(A)-halelængdefordelingen blev rekonstrueret ud fra den eksporterede csv-fil. Klik her for at se en større version af denne figur.

Dscam1
Fremadgående primer (5'-3') CGCAGCCACAACAATTGAATG
Omvendt primer (5'-3') AAATAAAATCAAAATCATATATTTAGCAACTTATGAAC
SV40
Fremadgående primer (5'-3') CCACAAAGGAAAAAGCTGCAC
Omvendt primer (5'-3') TTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTG
GAPDH
Fremadgående primer (5'-3') CACTTCAGAAACGGCCTGAAAATGGC
Omvendt primer (5'-3') AATATTTAAATGCTTATGAGTCGGCATTTTTAAAACTAC
Universal omvendt primer
Omvendt primer (5'-3') GGTAATACGACTCACTATAGCGAGACCCCCCCCCCTT

Tabel 1: Primere anvendt i denne protokol.

Supplerende fil 1: Sammensætning af opløsninger og PCR-opsætning. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne protokol beskriver vi teknikken til at dissekere Drosophila-larvehjernen fra vandrende 3. instar-stadium samt prøveforberedelsen fra Drosophila S2-celler. På grund af mRNA'ernes labile natur kræver prøveindsamling ekstra forsigtighed. Til larvehjernedissektion bør hjerner ikke beskadiges under isolering og bør ikke opbevares i opløsning i længere tid. Det er vigtigt at holde dissektionstiden til 8-10 minutter for en dissektionsrunde. Det kan også være gavnligt at supplere dissektionsopløsningen med RNAase-hæmmere. Hvad angår S2-celledyrkning og transfektion, skal du udføre alle trin i laminar strømningshætten.

RNA-isolationstrinnet kræver yderligere overvejelse. Vi anbefaler at bruge et laminært flowtype rent rum, der er forbehandlet med RNase-fjernende opløsninger. Bortset fra RNA-udbytte er det vigtigt at kontrollere RNA-integriteten for at sikre, at prøven ikke er blevet nedbrudt under dissektions- og isolationstrinnene. RNA-integritet kan visualiseres ved denaturering af agarosegelelektroforese. Det samlede RNA fra Drosophila udviser en enkelt båndprofil, fordi 28S rRNA er dissocieret i to lige store underenheder, som comigrerer med 18S rRNA25. Dette kan ses som et enkelt bånd på omkring 600 nukleotider, når der anvendes en enkeltstrenget RNA-stige (figur 2A).

Isolerede RNA-prøver udsættes for G / I-tailing (figur 2B). Guanosin- og inosinrester tilsættes i 3′-enden af RNA'er ved gærpoly(A)polymerase (PAP)17, som bevarer 3′-enden af RNA fra enzymatisk nedbrydning. De nyligt syntetiserede G / I-tag-beskyttede RNA'er i fuld længde transkriberes omvendt for at give cDNA-prøver ved hjælp af den universelle omvendte primer (3'-mærket C10T2). Efterfulgt af en PCR med de genspecifikke fremad/tilbage-primere lige opstrøms for polyadenyleringsstedet for at generere et PCR-produkt, der viser et skarpt bånd. PCR-reaktionerne fra en genspecifik fremadgående og de universelle omvendte primere genererer udefinerede længder af DNA-molekyler som et udtværing på gelen, hvilket afspejler varierende længder af poly (A) haler. PCR-produkterne blev efterfølgende analyseret ved kapillærgelelektroforese.

Ved design af primere er det vigtigt at bemærke, at amplionstørrelsen med genspecifikke fremad/omvendte primere skal ligge i området 50-300 bp. Test af flere fremadgående primere giver mulighed for at finde den bedste primer, der fungerer til poly (A) halevurdering. Vi anbefaler at designe en omvendt primer til genspecifikke produkter lige opstrøms for det forudsagte poly(A) startsted, fordi dette giver mulighed for enkel beregning af poly(A)-halelængderne. Når du kører PCR-reaktioner, er det vigtigt at udføre en "ingen revers transkriptasekontrol" for at udelukke amplifikation fra forurenet genomisk DNA. PCR-optimering med en udglødningstemperaturgradient anbefales stærkt. I betragtning af arten af denne metode kræver analyse af poly (A) halelængder af alternativt polyadenylerede mRNA-arter yderligere overvejelse. For eksempel gennemgår mange gener alternativ polyadenylering for at generere forskellige 3'UTR-arter26. Vi anbefaler at bruge forskellige PCR-primersæt til at studere individuelle 3'UTR-arter.

Vi anbefaler stærkt at inkludere det genspecifikke PCR-produkt på kapillærgelelektroforese i hver kørsel, da der er en potentiel migrationsforskel på nogle få nukleotider i hver kørsel. Det er vigtigt, at den faktiske baseparstørrelse af den genspecifikke PCR anvendes i stedet for de teoretiske størrelser ved beregning af poly(A) halelængde.

Nogle RNA'er gennemgår yderligere posttranskriptionelle modifikationer, herunder terminal uridylering27. G/I-tailing-metoden er muligvis ikke egnet til måling af poly(A)-halelængde, når mRNA'et uridyleres. Dette skyldes, at den universelle omvendte primer muligvis ikke effektivt forstærker mRNA-arten, der har ikke-adeninnukleotider i sin 3'-ende. G/I-tailing er en PCR-baseret metode, som potentielt skaber uønsket bias ved at forstærke kortere fragmenter mere effektivt. Således bør brugerne være forsigtige, når de fortolker resultatet.

Ved hjælp af den metode, der præsenteres her, demonstrerede vi, at G / I-tailing effektivt kan bruges til at måle poly (A) halelængde fra Drosophila-nervesystemet og S2-celler. Metoden er meget kvantitativ, når den kombineres med kapillærelektroforese. Mens analyser med høj kapacitet giver global poly (A) haleanalyse, er den PCR-baserede metode G / I-tailing med lav gennemstrømning stadig meget nyttig til enkelttranskriptanalyse, piloteksperimenter og validering af andre metoder. Sammenfattende afhænger valget af metode af de specifikke forskningsspørgsmål og mål. Forskere bør vælge den metode, der bedst passer til deres eksperimentelle behov og ressourcer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.

Acknowledgments

Denne undersøgelse blev støttet af National Institute of Neurological Disorders and Stroke Grant R01NS116463 til JK og Cellular and Molecular Imaging Core-faciliteten ved University of Nevada, Reno, som blev støttet af National Institutes of Health Grant P20GM103650 og brugt til forskning rapporteret i denne undersøgelse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS) Research Product Internation (RPI) M92020
Agilent High Sensitivity DNA Kit Agilent Technologies  5067-4626
Agilent software 2100 expert free download demo Agilent Technologies https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-software/2100-expert-software-228259
Apex 100 bp-Low DNA Ladder Genesee Scientific 19-109
Bioanalyzer Agilent 2100 Bioanalyzer G2938C
Diethyl pyrocarbonate (DEPC) Research Product Internation (RPI)  D43060
DNA dye (Gel Loading Dye, Purple (6x) New England biolabs  B7024S
Drosophila S2 cell line Drosophila Genomics Resource Center stock #181
Drosophila Schneider’s Medium Thermo Fisher Scientific 21720024
Ehidium bromide Genesee scientific  20-276
Fetal bovine serum (FBS) Sigma-Aldrich F4135
Forceps Dumont 5   Fine Science tools  11254-20
Nuclease free water Thermo Fisher Scientific  AM9932
PBS 10x Research Product Internation (RPI)  P32200
Poly(A) Tail-Length Assay Kit Thermo Fisher Scientific  764551KT
RiboRuler Low Range RNA Ladder Thermo Fisher Scientific  SM1833
RNA Gel Loading Dye (2x) Thermo Fisher Scientific  R0641
RNA microprep kit Zymoresearch  R1050 
RNA miniprep kit Zymoresearch  R1055
Scissors-Vannas Spring Scissors - 2.5 mm Cutting Edge Fine Science tools  15000-08
TopVision Agarose Tablets Thermo Fisher Scientific R2802
Tris-Acetate-EDTA (TAE) Thermo Fisher Scientific B49

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stewart, M. Polyadenylation and nuclear export of mRNAs. Journal of Biological Chemistry. 294 (9), 2977-2987 (2019).
  2. Machida, K., et al. Dynamic interaction of poly(A)-binding protein with the ribosome. Scientific Reports. 8 (1), 17435 (2018).
  3. Eisen, T. J., et al. The dynamics of cytoplasmic mRNA metabolism. Molecular Cell. 77 (4), 786-799 (2020).
  4. Liudkovska, V., Dziembowski, A. Functions and mechanisms of RNA tailing by metazoan terminal nucleotidyltransferases. Wiley Interdisciplinary Reviews RNA. 12 (2), e1622 (2021).
  5. Goldstrohm, A. C., Wickens, M. Multifunctional deadenylase complexes diversify mRNA control. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (4), 337-344 (2008).
  6. Schmidt, M. J., Norbury, C. J. Polyadenylation and beyond: emerging roles for noncanonical poly(A) polymerases. Wiley interdisciplinary reviews RNA. 1 (1), 142-151 (2010).
  7. Laishram, R. S. Poly(A) polymerase (PAP) diversity in gene expression - Star-PAP vs canonical PAP. FEBS Letters. 588 (14), 2185-2197 (2014).
  8. Salles, F. J., Lieberfarb, M. E., Wreden, C., Gergen, J. P., Strickland, S. Coordinate initiation of Drosophila development by regulated polyadenylation of maternal messenger RNAs. Science. 266 (5193), 1996-1999 (1994).
  9. Wreden, C., Verrotti, A. C., Schisa, J. A., Lieberfarb, M. E., Strickland, S. Nanos and pumilio establish embryonic polarity in Drosophila by promoting posterior deadenylation of hunchback mRNA. Development. 124 (15), 3015-3023 (1997).
  10. Passmore, L. A., Coller, J. Roles of mRNA poly(A) tails in regulation of eukaryotic gene expression. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 23 (2), 93-106 (2021).
  11. Murray, E. L., Schoenberg, D. R. Assays for determining poly(a) tail length and the polarity of mRNA decay in mammalian cells. Methods in Enzymology. 448, 483-504 (2008).
  12. Salles, F. J., Strickland, S. Analysis of poly(a) tail lengths by PCR: The PAT assay. Methods in Molecular Biology. 118, 441-448 (1999).
  13. Salles, F. J., Darrow, A. L., O'Connell, M. L., Strickland, S. Isolation of novel murine maternal mRNAs regulated by cytoplasmic polyadenylation. Genes and Development. 6 (7), 1202-1212 (1992).
  14. Salles, F. J., Strickland, S. Rapid and sensitive analysis of mRNA polyadenylation states by PCR. Genome Research. 4 (6), 317-321 (1995).
  15. Janicke, A., Vancuylenberg, J., Boag, P. R., Traven, A., Beilharz, T. H. ePAT: A simple method to tag adenylated RNA to measure poly(a)-tail length and other 3' RACE applications. RNA. 18 (6), 1289-1295 (2012).
  16. Minasaki, R., Rudel, D., Eckmann, C. R. Increased sensitivity and accuracy of a single-stranded DNA splint-mediated ligation assay (sPAT) reveals poly(a) tail length dynamics of developmentally regulated mRNAs. RNA Biology. 11 (2), 111-123 (2014).
  17. Martin, G., Keller, W. Tailing and 3'-end labeling of RNA with yeast poly(A) polymerase and various nucleotides. RNA. 4 (2), 226-230 (1998).
  18. Kusov, Y. Y., Shatirishvili, G., Dzagurov, G., Verena, G. M. A new G-tailing method for the determination of the poly(a) tail length applied to hepatitis a virus RNA. Nucleic Acids Research. 29 (12), 57 (2001).
  19. Bazzini, A. A., Lee, M. T., Giraldez, A. J. Ribosome profiling shows that miR-430 reduces translation before causing mRNA decay in zebrafish. Science. 336 (6078), 233-237 (2012).
  20. Subtelny, A. O., Eichhorn, S. W., Chen, G. R., Sive, H., Bartel, D. P. Poly(a)-tail profiling reveals an embryonic switch in translational control. Nature. 508 (1), 66-71 (2014).
  21. Chang, H., Lim, J., Ha, M., Kim, V. N. TAIL-seq: Genome-wide determination of poly(a) tail length and 3' end modifications. Molecular Cell. 53 (6), 1044-1052 (2014).
  22. Legnini, I., Alles, J., Karaiskos, N., Ayoub, S., Rajewsky, N. FLAM-seq: Full-length mRNA sequencing reveals principles of poly(A) tail length control. Nature Methods. 16 (9), 879-886 (2019).
  23. Garalde, D. R., et al. Highly parallel direct RNA sequencing on an array of nanopores. Nature Methods. 15 (3), 201-206 (2018).
  24. Singh, M., Ye, B., Kim, J. H. Dual leucine zipper kinase regulates Dscam expression through a noncanonical function of the cytoplasmic poly(A)-binding protein. Journal of Neuroscience. 42 (31), 6007-6019 (2022).
  25. Macharia, R. W., Ombura, F. L., Aroko, E. O. Insects' RNA profiling reveals absence of "hidden break" in 28S ribosomal RNA molecule of onion thrips, Thrips tabaci. Journal of Nucleic Acids. 2015, 965294 (2015).
  26. Miura, P., Sanfilippo, P., Shenker, S., Lai, E. C. Alternative polyadenylation in the nervous system: to what lengths will 3' UTR extensions take us. Bioessays. 36 (8), 766-777 (2014).
  27. Sement, F. M., et al. et al Uridylation prevents 3' trimming of oligoadenylated mRNAs. Nucleic Acids Research. 41 (14), 7115-7127 (2013).

Tags

Neurovidenskab udgave 203
Måling af Poly A halelængde fra <em>Drosophila</em> larve hjerne og cellelinje
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Singh, M., Kim, J. H. Measurement of … More

Singh, M., Kim, J. H. Measurement of Poly A Tail Length from Drosophila Larva Brain and Cell Line. J. Vis. Exp. (203), e66116, doi:10.3791/66116 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter