Summary
本プロトコルは、ラットの腹部迷走神経に電極アレイを埋め込むための外科的技術と、埋め込まれたデバイスを使用した慢性電気生理学的検査および刺激の方法を説明する。
Abstract
腹部迷走神経刺激(VNS)は、ラットの迷走神経の横隔膜下枝に適用できます。その解剖学的位置により、子宮頸部VNSに一般的に関連する呼吸器および心臓のオフターゲット効果はありません。呼吸器および心臓のオフターゲット効果がないため、子宮頸部VNS中に一般的に経験される副作用を軽減するために刺激の強度を下げる必要はありません。炎症性腸疾患、関節リウマチ、および2型糖尿病のラットモデルにおける血糖低下のラットモデルにおける腹部VNSの抗炎症効果を示す最近の研究はほとんどありません。ラットは、迷走神経の解剖学的構造が確立されていること、神経のサイズが大きいため取り扱いが容易であること、および多くの疾患モデルが利用できるため、この技術の可能性を探るのに最適なモデルです。ここでは、ラットにおける腹部VNS電極アレイの洗浄および滅菌方法と手術プロトコルについて説明します。また、誘発された化合物活動電位を記録することにより、閾値超刺激を確認するために必要な技術についても説明します。腹部VNSは、炎症性疾患を含む様々な疾患に対して選択的かつ効果的な治療を提供する可能性を秘めており、子宮頸部VNSと同様に用途拡大が期待されています。
Introduction
頸部の頸部に照射する迷走神経刺激療法(VNS)は、難治性てんかん、難治性うつ病、虚血性脳卒中後のリハビリテーション1に対して米国食品医薬品局(FDA)が承認した治療薬であり、欧州では心不全に対して欧州委員会が承認した治療薬2です。非侵襲的頸部VNSは、片頭痛と頭痛に対してFDA承認されています1。その用途は拡大すると予想され、最近の臨床試験では、クローン病3、関節リウマチ4,5、耐糖能障害、2型糖尿病6,7などの他の適応症でのVNSの有効性が示されています。有望ではあるが、頸部VNSは、肺と心臓を神経支配する神経線維のオフターゲット活性化により、徐脈や無呼吸を引き起こす可能性がある8,9,10。咳、痛み、声の変化、頭痛、無呼吸低呼吸指数の増加などの副作用は、子宮頸部VNS11,12を受けている患者で一般的に報告されています。刺激強度の低下は、これらの副作用を軽減するための一般的な戦略ですが、電荷の減少は、治療用繊維を活性化できないことにより、VNS療法の有効性を制限する可能性があります11。この仮説を裏付けるように、てんかんの治療のために高強度の刺激を受けた患者のレスポンダー率は、低強度の刺激を受けた患者のレスポンダー率よりも高かった13。
腹部VNSは、肝臓および腹腔枝の上にある横隔膜下迷走神経に適用されます14(図1)。私たちの以前の研究は、ラットで腹部VNSが子宮頸部VNSに関連する心臓または呼吸器の副作用を引き起こさないことを実証しました10。以前の研究では、炎症性腸疾患と関節リウマチのラットモデルにおける腹部VNSの抗炎症効果も実証されています10,15、および2型糖尿病のラットモデルにおける血糖の減少16。最近、腹部VNS技術は、炎症性腸疾患(NCT05469607)の治療のためのファースト・イン・ヒューマン臨床試験に転用されました。
腹部迷走神経(WO201909502017)に刺激を与えるために使用される末梢神経電極アレイは、ラットで使用するためにカスタム開発されたもので、4.7mm間隔で配置された2〜3組の白金電極ペアで構成され、医療グレードのシリコンエラストマーカフ、アレイを食道に固定するための縫合タブ、リード線、および腰部に取り付けられる経皮的コネクタによって支えられています(図2).リード線は動物の左側の皮膚の下にトンネルを掘っています。複数の電極ペア設計により、神経の電気刺激が可能になるだけでなく、電気的に誘発された複合活動電位(ECAP)を記録し、神経へのインプラントの正しい配置と閾値超刺激強度を確認できます。腹部VNSは、10,15,16か月間、自由に動くラットで忍容性が良好です。これにより、疾患モデルに対する有効性を評価することができます。
この原稿では、さまざまな疾患モデルにおける腹部VNSの有効性を研究するために、電極アレイ滅菌、腹部迷走神経移植手術、および覚醒ラットにおけるECAPの慢性刺激と記録の方法について説明します。これらの方法は、もともと炎症性腸疾患10 のラットモデルにおける腹部VNSの有効性を研究するために開発され、関節リウマチ15 および糖尿病16のラットモデルにも成功裏に使用されています。
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Protocol
動物に関するすべての処置は、セントビンセント病院(メルボルン)の動物倫理委員会によって承認され、科学的目的のための動物のケアと使用に関するオーストラリア法(オーストラリア国立保健医療研究評議会)および動物虐待防止法(1986年)に準拠しています。合計で、24匹の雌のダークアグーチラット(8〜9週齢)がこの研究に使用されました。実験グループは以下で構成されていました:コラーゲン注射またはVNSインプラントを受けていない正常なコホート(n = 8)。インプラントとコラーゲン注射を受けた刺激されていない疾患コホート(n = 8)(電気生理学的検査は実施されていない)。インプラント、コラーゲン注射、電気生理学的検査、およびVNS療法を受けた刺激疾患コホート(n = 8)。コラーゲン注入の5日前に移植手術を行い、コラーゲン注入の4日後にVNS療法の馴化を開始し、7日間にわたって行われました。VNS療法は、コラーゲン注射後11日目から17日目まで適用されました15。刺激性疾患コホートでは、麻酔下での着床手術直後、コラーゲン注入日、コラーゲン注入10日後、および終了日(コラーゲン注入17日後)に電気生理学的検査を実施した。
1.電極アレイの超音波処理と滅菌
- 超音波洗浄機の周波数を80kHzに設定し、超音波タンクに水道水を入れます。電極アレイを清潔なプラスチック容器の洗浄液に浸し、超音波タンクに入れます。
注:各ステップに使用する洗浄液と超音波処理時間を 表1にまとめます。各ステップに清潔な容器を使用してください。 - 超音波処理された電極アレイを、蒸留水中の0.5%液体洗浄液で超音波処理し、蒸留水ですすいだ清潔な鉗子を使用して滅菌バッグに入れます。電極アレイを最高温度130°Cで45分間オートクレーブし、クリーンベンチで乾燥させます。
2. 腹部迷走神経への電極アレイの埋め込み
注:この研究では、雌の暗アグーチラット(8〜9週齢)を使用しました15。また、このプロトコルを使用して、成体のオスのSprague-Dawleyラット(10〜14週齢)を慢性的に移植することにも成功しました10,16。手術は無菌状態で行われ、すべての器具、電極アレイ、ガーゼや綿先などの消耗品はオートクレーブ滅菌されます。
- 誘導チャンバー内で、3%イソフルランと1L/minの酸素を使用してラットを麻酔します。つま先をつまむためのペダル反射がなくなったら、手術台の上のサーモスタットでラットをヒートマットに移動し、イソフルランマスクを鼻の上に置きます。
- 手術中は呼吸数と直腸温を監視し、イソフルランレベルを1.5%から2.5%の間で調整して、呼吸数を毎分40〜62回に維持します。.直腸の温度範囲を35.9〜37.5°Cに維持するために、必要に応じてヒートマットの設定を調整します。
- 手術開始前に、25Gの針(カルプロフェン5 mg / kgおよびブプレノルフィン0.03 mg / kg皮下)を備えた1 mLシリンジを使用して、鎮痛前投薬を皮下投与します。.
- 切開部位の周囲をたっぷりと剃り、甲状突起から胸郭の端までの腹側正中線に沿った領域、背側正中線に沿った背中の腰部、前肢と後肢の間の体の左側など、アレイの皮下トンネルを可能にします。
- ベタジンとアルコールを交互に浴びて手術部位を円を描くように3回洗浄し、動物の上に外科用ドレープを置きます。ブピバカイン(1〜2 mg / kg)を皮下投与します 背側と腹側の切開部位に25Gの針が付いた1 mLの注射器を使用します。.
- 動物を腹側横臥に置き、メスの刃を使用して経皮的台座を固定する背中に長さ2cmの切開を行います。
- ラットを背側横臥に向け、メスの刃を使用して、xyphoid突起のすぐ下の正中線に沿って皮膚を3cm切開します。切開部位付近の皮膚を持ち上げ、解剖ハサミを使用して、切開部の周りの筋肉層から皮膚層を鈍く解剖します。
- 台座から着床部位までのアレイの皮下トンネリングを可能にするには、動物を右側に置き、腹側切開部位から止血を挿入し、背側切開部位に向かって鈍く解剖します。ニードルキャップの縁を切り取り、電極アレイを挿入して輸送中に保護します(図1B)。手(滅菌手袋を着用)を使用して、皮膚の下の電極アレイを腹側切開部に向かってトンネルします。
- 食道と迷走神経にアクセスするには、動物を再び背臥位に横たえます。キシフィス突起の下の正中線に沿って筋肉層を3cm切開し、肝臓の全長を露出させるのに十分な大きさにします。このステップ中に肝臓を傷つけないようにしてください。
- 主腹側切開部までの筋肉層(動物の左側)を横方向に小さく(1cm未満)切開します。ステップ2.8で使用したニードルキャップを使用して、この小さな切開部に電極アレイをトンネルし、アレイを腹腔に挿入します。
注:このステップは、主要な切開部位に加えられる張力を軽減し、縫合糸が破裂するリスクを軽減します。 - 皮膚と筋肉の層を引っ込めて、腹腔を開いたままにします。滅菌生理食塩水に浸した綿の先端とガーゼを使用して組織を湿らせてください。
- バンナハサミを使用して肝臓の周りの結合組織を切断し、保護のために生理食塩水に浸したガーゼの小片の上にリトラクターを置くことにより、肝臓を静かに引っ込めます。食道と胃の間にリトラクターを配置して、食道とその上にある迷走神経をまっすぐにするために、胃を静かに引っ込めます。
注:リトラクターは、釣り針の先のとがった端を丸めることによって作られます。 - 食道の腹面を露出させた後、腹部迷走神経とその副枝(肝神経、腹腔神経、2つの胃枝を含む)を特定します(図1D)。
- 腹部迷走神経を食道に固定している結合組織を細い鉗子とバンナハサミで切断し、肝枝と腹腔枝のすぐ上から横隔膜に向かって神経の長さを解剖します。神経を引き裂いたり、伸ばしたり、挟んだりしないように注意してください。神経の隣に電極アレイを配置して、アレイに収まるように十分な長さの神経が結合組織から分離されていることを確認します。
- 神経の周りの結合組織が取り除かれたら、神経の下のアレイカフの電極側にシルク縫合糸(7-0)を通します。アレイのカフを開き、神経をアレイチャネルに慎重に配置します。
- 神経の全長がアレイチャネル内にあることを確認してください。カフの周りの縫合糸を結び、カフをしっかりと閉じて、神経がチャネルから滑り落ちないようにします。縫合糸をトリミングします。
- 7-0シルク縫合糸を使用して、アレイのタブを食道に縫合し、アレイを所定の位置に固定し、ねじれを防ぎます。迷走神経の他の枝を傷つけたり、食道平滑筋に針を深く刺しすぎたりしないでください。
- リトラクターをそっと取り外し、すべてのガーゼが腹腔から取り除かれていることを確認します。腹腔内に1 mLのシリンジを使用して1〜2 mLの温かい滅菌生理食塩水を投与し、肝臓を正しい位置に再配置します。.
- 簡単なランニング縫合法を使用して3-0シルク縫合糸で筋肉層を閉じ、両端に少なくとも3回投げて安全な正方形の結び目を作ります。スペースステッチを密着(約3mm間隔)して、ヘルニア/キシフィス突起の突出などの合併症を防ぎます。
- 縫合糸を使用して腹膜の切開を筋肉層の切開と一緒に閉じ、組織癒着の可能性を減らします。
- 吸収性縫合材料(Vicryl 4-0)を使用して、皮膚切開部を閉じます。動物が縫合糸を抜くのを防ぐために、ランニング埋設垂直マットレス縫合糸やランニング埋設皮膚縫合糸などの埋設縫合技術を使用してください。
- 動物を腹側横臥に向け、ハサミを使用して背側切開を4〜5 cmに伸ばし、経皮的コネクタのコネクタベースが筋肉層に平らに収まるように、筋肉と皮膚層の間をさらに鈍く解剖します。
- シルク3-0縫合糸を使用して、コネクタベースの周りに6〜8本の簡単な断続縫合糸を作成し、下の筋肉層に固定します。水平マットレス縫合技術を使用して、シルク3-0縫合糸で皮膚切開を閉じ、少なくとも3回のスローでしっかりとした正方形の結び目を確保します。
注:このステップでは、編組シルク縫合糸は、モノフィラメント縫合糸と比較して、取り扱いが容易で、より安全な結び目を作成する能力があるため、好まれます。 - 手術終了時に、ハルトマン溶液を皮下投与します(1 mL / 100 g / h)。イソフルランをオフにし、酸素(1.5 L / min)を流しながらヒートマットの上で動物を回復させます。ラットが意識を取り戻し、完全に動けるようになったら、麻酔薬から完全に回復するまで、ラットをホームケージに戻し、ヒートパッドの上に置きます。
- イソフルランからの動物の回復を注意深く観察し、動物が食べ物や飲み物にアクセスできることを確認してください。次の2日間で、痛みを和らげるために、術後鎮痛剤(カルプロフェン5 mg / kg、毎日)の皮下投与を行います。.1日2回以上動物を観察し、排便の痕跡、被毛の質、活動レベル、手術創からの腫れや分泌物の有無を確認します。
- 動物の体重を記録し、まれに動物が10%以上減少した場合は、集中治療を開始します。集中治療には、毎日の水分(ハルトマン溶液、2x 10 mL)の皮下投与、新鮮な野菜や栄養ジェルサプリメントなどの追加の餌の提供、ケージの半分をサーモスタット付きのヒートパッドの上に置いてさらに暖かくすることが含まれます。動物が回復するまで、モニタリングの頻度を増やします。必要に応じて、Grimaceスケールに基づいて鎮痛剤(カルプロフェン5 mg / kg、SQ、毎日)の投与を続けます。.
3. 電気生理学的検査
注:誘発化合物活動電位(ECAP)を記録することで、迷走神経上の電極アレイの適切な配置を確認できます。さらに、上記の電極アレイを使用したECAPの記録により、迷走神経C線維および閾値超VNSの電気的活性化が確認できる可能性があります10,15。
- ECAPを記録する前に、電極の共通接地インピーダンスを測定して完全性を評価し、ワイヤの開回路または短絡を検出します。 in vivo で機能する腹部迷走神経電極は、4〜20kΩのインピーダンス値を持つ必要があります。
- 麻酔をかけている間、すなわち手術直後、または覚醒して自由に動いている状態で動物を試験する。手術後少なくとも2〜3日後に覚醒検査を行い、手術後の皮膚の傷が治癒して安定するのを待ちます。インピーダンスおよび電気生理学的試験に必要な機器(カスタムメイドの刺激装置、データ収集デバイス、絶縁差動アンプ、データ収集および解析ソフトウェアなど)を材料 表に記載のとおりに集めます。
- 必要に応じて動物をタオルで包み、ケーブルを背面経皮コネクタに接続し、ケーブルのもう一方の端を刺激装置に接続します。電極の共通接地インピーダンスをテストするには、対象の電極とアレイ上の他のすべての電極の間に二相性電流パルス(位相あたり100μs、電流107μA)を印加します。
- 電圧波形の第1相終了時のピーク電圧(V合計)を測定し、オームの法則(Z=電圧/電流)を使用して全インピーダンス(Z合計)を計算します。
- 一対の電極を刺激装置に、一対の電極を記録装置に接続し、皮膚下に配置したVNSインプラントの参照電極をECAPの差動記録の基準として、バイポーラ刺激を印加してECAPを生成します。データ収集および解析ソフトウェアを使用して、合計 50 回の繰り返しから平均した 2 セットの記録を行います。
- 測定には次の設定を使用します。
電流:0.1mA刻みで0〜2mA。
パルス幅:25 - 200 μs;
間相ギャップ:8〜50μs;
刺激速度:10〜30パルス/秒。
サンプリングレート:100 kHz;
フィルター:ハイパス200Hz、ローパス2000Hz、電圧ゲイン1 x 102。 - データ解析ソフトウェアを使用して、解析ウィンドウ内の波形のピークtoピーク電圧(刺激後4〜10ms、図3A、Bの網掛けで表示)を測定してECAP応答を解析します。ECAP閾値は、平均電気生理学的記録の両方のセットで少なくとも0.1μVのピーク-ピークの応答振幅を生成する最小刺激電流強度として定義されます。有効な応答は、閾値を超える少なくとも2つの電流レベルに対して繰り返され、閾値10,15を下回る少なくとも2つの電流レベルに対しては存在しません。
4. 覚醒ラットにおける慢性腹部VNS
注:腹部VNSは、経皮的コネクターの周りの外科的創傷が治癒して安定すると、覚醒している動物に適用できます。ストレス反応を軽減し、より良いデータ収集を可能にするために、動物は、移植手術とVNS療法の開始前に、7日間にわたって1日1時間、テスターの取り扱いと刺激の環境に慣れています。
- VNSを適用する前に、ステップ3.4の説明に従って各電極のインピーダンスを測定します。刺激電極のインピーダンスが20kΩ未満であることを確認してください。
- ケーブルを背面の経皮コネクタに接続し、ケーブルのもう一方の端を、適切な刺激(例:27 Hz、1.6 mA、200 μsのパルス幅、50 μsの相間ギャップ、30秒オン、2.5分オフ15)を適用するようにプログラムされた刺激装置に接続し、刺激装置をオンにします。
注意: 動物は、適切に慣れていれば、刺激中に眠りに落ちるのがよく観察されますが、噛まれないように、可能な限りスチールコイルなどの保護外装材を備えたケーブルを使用してください。 - 各VNS療法セッションの開始時に動物を観察し、過度のグルーミングや刺激のタイミングに同期した活動レベルの急激な増減などの副作用がないことを確認します。
- 30分ごとに監視して、ケーブルのねじれや断線がないか確認します。VNSを慢性的に適用するには(例:7日間15で1日3時間)、各セッションの開始時に手順4.1〜4.3を繰り返します。
注意: 整流子を使用すると、ケーブルがねじれる可能性が低くなり、監視の頻度が少なくて済む場合があります。
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Representative Results
手術直後に誘発された複合活動電位(ECAP、 図3A、B)を記録することは、アレイチャネル内の神経の正しい配置を確認するために使用できる技術であり、その刺激は迷走神経の活性化に効果的です。
図3では、雌の暗色アグーチラット(8〜9週齢)にVNS電極アレイを移植しました。治療刺激を受けるように無作為に選択されたラットでは、ECAPは手術直後(0日目、図3A)およびVNS治療セッションの終了時(23日目、図3B)に記録されました。.ECAPの存在(図3B)は、刺激強度が神経閾値を超えており、神経が正常に活性化されていることを示しました。VNS治療群の動物は、ECAPが記録されていない場合、刺激がうまく送達されたという保証がなかったため、除外されました15。神経応答の潜伏時間(図3A、B、緑色の矢印で表示)は、どのクラスの線維が活性化されたかを評価するために使用できます。
以前の研究では、ほとんどの神経応答は通常、4ミリ秒から10ミリ秒の間に発生することが観察されています10,15。刺激対と記録対の間の距離が4.7 mmであることを考えると、この応答ウィンドウのおおよその伝導速度は0.47 - 1.2 m / sであり、これはC線維18の伝導速度と一致します。
0日目(377μA、図3A)と23日目(1335μA、図3B)の間に神経閾値の増加があり、これは、組織−電極界面の周囲に形成される軽度の良性線維症が原因である可能性が高い10,15。
図3C は、実験的なテストのセットアップとバックコネクタの位置を示しており、3週間のテスト期間15の間、安定していました。
図1:頸部VNSと腹部VNSの部位。 (A)頸部VNSは枝の上から心臓と気道に、腹部VNSはこれらの枝の下に適用されます。(B)電極アレイをニードルキャップ(縁を取り外した状態)に挿入して、皮膚下のトンネル掘削中に保護します。(C)ラット腹部VNSアレイを移植し、腹腔病の上に縫合糸(D)を、横隔膜の下に肝枝を固定します。略語:VN =迷走神経、b.=枝。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:ラットVNSアレイ。 (A)ラットVNSアレイは、経皮的コネクタとリード線で接続された電極アレイで構成されています。(B)電極アレイの近くのタブを食道に縫合して、アレイの位置を安定させることができる。標準的なラット腹部迷走神経アレイには、2つの電極対(E1とE2、E3とE4)が付属しています。両方の電極対は、刺激または記録のいずれかに使用できます。経皮的コネクタは動物の木材領域に取り付けられ、リード線は動物の左側の皮膚の下にトンネルされます。リード線に沿った参照電極は、電極アレイが埋め込まれると、動物の左側の皮膚の下に配置されます。電極アレイは、胃の上、横隔膜のすぐ下の食道に沿って迷走神経に埋め込まれます。(C)皮膚の下の動物の左側にあるリード線の長さが余分に伸びているため、緊張が軽減されます。略語:E =電極。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:慢性着床中の腹部迷走神経から記録された典型的な電気生理学的痕跡とVNS療法を受けたラット 。 (A)各電気生理学トレースは、平均25回の繰り返しです。緑色の網掛けボックスは、ラット腹部迷走神経におけるC線維応答の典型的な潜伏時間(4ミリ秒から10ミリ秒の間)を示しています(刺激電極対と記録電極対の間を中心から中心まで4.7mmの距離で電極アレイを使用)。ECAPには緑色の矢印が付いています。(B)ホームケージ内で仰向けの経皮的コネクターを介してVNS療法を受けているラット。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
| 洗浄液 | 超音波処理時間 |
| 1. 超純水中の0.5%パイロネグ | 15分 |
| 2. 超純水 | 5分 |
| 3. 超純水 | 5分 |
| 4. 96%エタノール | 10分 |
| 5. 超純水 | 5分 |
| 6. 超純水 | 5分 |
表1:超音波処理のステップ。 表は、ここで実行される超音波処理の詳細を示しています。
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Discussion
腹部VNSインプラント手術と迷走神経の慢性刺激およびECAPの記録のこの方法は、移植後のラットで5週間使用され、忍容性が良好です10,15,16。胃、肝臓、腸を引っ込めて食道と迷走神経をよく見ることは、手術の重要なステップの1つです。これらの臓器が引っ込められると、迷走神経にアクセスできるようになります。胃を引っ込めると呼吸が損なわれるリスクがあり、その場合、収縮器が緩みます。さらに、食道周囲の結合組織を切断して迷走神経にアクセスする場合は、胸腔内圧の乱れ、重度の呼吸抑制、および手術中の動物の死亡につながる可能性のある横隔膜の損傷を避けるように注意する必要があります。食道を取り巻く結合組織は、肝および腹腔枝の上の電極アレイに収まる程度に除去することをお勧めします。
術後の合併症としては、食道周辺の組織癒着、ヘルニア、術後イレウスなどがあります。組織の付着は、手術中および腹腔を閉じる前に腹腔内に滅菌生理食塩水をたっぷりと塗布することによって最小限に抑えることができます。腹膜層を筋肉層と一緒に閉じる縫合糸は、内臓を保護し、組織の癒着を減らすのにも役立ちます。肝臓は傷つきやすく、腸を操作すると術後のイレウスを引き起こす可能性があるため、これらの臓器の取り扱いは最小限で穏やかに行うことが重要です。最後に、特に体重の重い動物では、ヘルニアや糸状突起の突出を防ぐために、腹腔を閉じるときは、ランニング縫合糸を互いに近づけて配置するか、代わりに中断縫合糸を使用することが重要です。
標準的な術後ケアとして、動物は手術後に定期的にチェックされ、排便、体重変化、被毛、活動レベル、および手術創からの腫れや分泌物の存在の証拠がないか確認する必要があります。まれに、手術創の周囲に過剰な分泌物、発赤、腫れが起こり、感染を示唆することがあります。そのような場合、ベイトリル(0.2 mg / mL、飲料水に3〜5日間)などの抗生物質が感染が解消するまで投与されます。正常なラットは一般的に手術からよく回復しますが、健康状態が損なわれているラット(すなわち、疾患モデル)は、手術後に検査と刺激が始まるまでにさらに時間がかかる場合があります。そのような動物に対する適切な術後ケア(ステップ2.26で要約)は、動物の福祉のために不可欠です。
このプロトコルの限界の1つは、ラットVNS電極アレイの設計は、より遅いCファイバー応答を記録するのに優れているが、電極対間の間隔(4.7 mm)は、より速いファイバータイプの一部の活性を捕捉するのに適していない可能性があることである。アレイの全長は、肝臓と腹腔の枝の上にある横隔膜下迷走神経の利用可能な長さによって制限されますが、これらのVNSアレイは追加の電極ペアで購入することができます。このようなアレイは、VNS16,19の方向を操作できるブロッキング刺激の応用を探求するために使用され得、このモデルの使用の可能性を拡大することができる。
ECAPの記録は、神経周囲のアレイの配置、電極界面の品質、および迷走神経線維を活性化するデバイスの能力を評価するために使用できます。迷走神経は自律神経であり、透過型電子顕微鏡研究20で確認されているように、97%-99%のC線維18,20で構成され、残りの1%-3%の線維は有髄線維(機能は不明)である。図3の応答は、末梢神経の複合活動電位の形状と形態に適合するため、筋原性活動ではなく、迷走神経の電気的に誘発された活動によるものである可能性が高い21,22。さらに、ラット腹部迷走神経ECAPの典型的な伝導速度は0.47-1.2m/sであり、これはC線維18の伝導速度と一致している。初期のデバイス開発パイロット研究では、刺激電極と記録電極の間の迷走神経を切断することにより、麻酔ラット試験で記録が検証され、誘発反応が排除されました(データは示されていません)。電極アレイは、迷走神経が白金-シリコーンチャネル内に配置されるように設計されており、周囲の構造構造(食道など)から効果的に電気的に隔離されます。また、刺激と記録は、隣接する電極を利用したバイポーラ構成を使用して行われ、刺激の拡散と記録の汚染の機会をさらに最小限に抑えます。麻酔および覚醒製剤における腹部迷走神経の電気刺激後の同様の波形を一貫して報告しています10,15,16,19,23、刺激の生理学的効果が迷走神経の活性化を確認した研究を含む10,15,16.筋原性活性による記録の汚染を排除することは不可能であるが、筋原性応答は、我々の研究10,15および図3A,Bで観察された段階的で小さな成長プロファイルとは対照的に、急速で大きな成長振幅プロファイル24のために、通常、神経応答と区別できる。 0日目:現在のレベル 377 μA レイテンシ: 7.24ms>電流レベル1750μA:6.74ms。
ほぼ完全にC線維20,25で構成される横隔膜下迷走神経の活性化は、炎症性腸疾患10、関節リウマチ15、糖尿病16の前臨床モデルの治療に有効であることが示されていますが、その治療効果を最大化するための最適な腹部VNSパラメータは十分に調査されていません14.炎症性腸疾患の治療のための腹部VNSの適用が現在、ファーストインヒューマン臨床試験で調査されているため、このトピックに関するさらなる研究は大きな利益となるでしょう。腹部VNSの抗炎症作用は全身性であると考えられるため26、全身性エリテマトーデス27や慢性腎臓病28など、他の炎症性疾患にも有効である可能性が大いにある。
私たちのラット研究は、腹部VNSが心臓または呼吸器のオフターゲット効果を引き起こさないという点で、子宮頸部VNSよりも独自の利点を持っていることを示しています10。より高い強度の刺激は、動物の呼吸や心拍数を損なうことなく、より長い期間適用することができます。この方法は、閾値超刺激強度を確認する誘発神経応答を監視する機能と組み合わせることで、さまざまな疾患の治療に対する腹部VNSの有効性を研究するための優れたモデルを提供します。VNSの用途が拡大し続ける中、このVNS方式の用途も拡大することが予想されます。
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Disclosures
この調査は、潜在的な利益相反と解釈される可能性のある商業的または金銭的関係がない状態で実施されました。
Acknowledgments
ラット腹部VNSインプラントの開発は、国防高等研究計画局(DARPA)BTOの資金提供を受け、Doug Weber博士とEric Van Gieson博士の後援の下、Space and Naval Warfare Systems Center(契約番号N66001-15-2-4060)を通じて行われました。本誌で報告された研究は、Bionics Institute Incubation Fundの支援を受けました。バイオニクス・インスティテュートは、ビクトリア州政府から運用インフラ支援プログラムを通じて受けた支援を認めています。機械設計のOwen Burns氏、解剖学の専門知識をしてくれたJohn B Furness教授、末梢界面、ニューロモデュレーション、レコーディングの専門知識をしてくれたRobert K Shepherd教授、畜産と試験のPhilippa Kammerer氏とAmy Morley氏、術後の動物ケアに関するアドバイスをしてくれたFenella Muntz氏とPeta Grigsby博士、VNSアレイの製造についてNeoBionicaのJenny Zhou氏と電極製造チームに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% saline | Briemarpak | SC3050 | |
| Baytril | Bayer | ||
| Betadine | Sanofi-Aventis Healthcare | ||
| Buprelieve (Buprenorphine) | Jurox | ||
| Data acquisition device | National Instruments | USB-6210 | |
| DietGel Boost (dietary gel supplement) | ClearH2O | ||
| Dumont tweezer, style 5 | ProSciTech | T05-822 | |
| Dumont tweezer, style N7, self-closing | ProSciTech | EMS72864-D | |
| Elmasonic P sonicator | Elma | ||
| Hartmann's solution | Baxter | AHB2323 | |
| Hemostat | ProSciTech | TS1322-140 | |
| HPMC/PAA Moisturising Eye Gel | Alcon | ||
| Igor Pro-8 software | Wavemetrics, Inc | ||
| Isoflo (Isoflurane) | Zoetis | ||
| Isolated differential amplifier | World Precision Instruments | ISO-80 | |
| Liquid pyroneg | Diversey | HH12291 | cleaning solution |
| Marcaine (Bupivacaine) | Aspen | ||
| Plastic drape | Multigate | 22-203 | |
| Rat vagus nerve implant | Neo-Bionica | ||
| Rimadyl (Carprofen) | Zoetis | ||
| Silk suture 3-0 | Ethicon | ||
| Silk suture 7-0 | Ethicon | ||
| SteriClave autoclave | Cominox | 24S | |
| Sterile disposable surgical gown | Zebravet | DSG-S | |
| Suicide Nickel hooks | Jarvis Walker | ||
| Ultrapure water | Merck Millipre | Milli-Q Direct | |
| Underpads | Zebravet | UP10SM | |
| Vannas scissors | ProSciTech | EMS72933-01 | |
| Vicryl suture 4-0 | Ethicon |
References
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