Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Enkeltmolekylemåling af proteininteraktionsdynamik inden for biomolekylære kondensater

Published: January 5, 2024 doi: 10.3791/66169
Automatic Translation
1,2, 1
1Division of Chemistry and Chemical Engineering, California Institute of Technology, 2Division of Biology and Biological Engineering, California Institute of Technology

Summary

Mange iboende uordnede proteiner har vist sig at deltage i dannelsen af meget dynamiske biomolekylære kondensater, en adfærd, der er vigtig for mange cellulære processer. Her præsenterer vi en enkeltmolekyle imaging-baseret metode til kvantificering af dynamikken, hvormed proteiner interagerer med hinanden i biomolekylære kondensater i levende celler.

Abstract

Biomolekylære kondensater dannet via væske-væskefaseseparation (LLPS) er blevet betragtet som kritiske i cellulær organisation og et stigende antal cellulære funktioner. Karakterisering af LLPS i levende celler er også vigtig, fordi afvigende kondens har været forbundet med adskillige sygdomme, herunder kræft og neurodegenerative lidelser. LLPS er ofte drevet af selektive, forbigående og multivalente interaktioner mellem iboende uordnede proteiner. Af stor interesse er interaktionsdynamikken for proteiner, der deltager i LLPS, som er godt opsummeret ved målinger af deres bindende opholdstid (RT), det vil sige den tid, de bruger bundet inden for kondensater. Her præsenterer vi en metode baseret på levende celle enkeltmolekyle billeddannelse, der giver os mulighed for at måle den gennemsnitlige RT af et specifikt protein i kondensater. Vi visualiserer samtidig individuelle proteinmolekyler og de kondensater, som de associerer med, bruger enkeltpartikelsporing (SPT) til at plotte enkeltmolekylebaner og tilpasser derefter banerne til en model af protein-dråbebinding for at ekstrahere proteinets gennemsnitlige RT. Endelig viser vi repræsentative resultater, hvor denne enkeltmolekyle-billeddannelsesmetode blev anvendt til at sammenligne de gennemsnitlige RT'er af et protein ved dets LLPS-kondensater, når de smeltes og ikke smeltes sammen med et oligomeriserende domæne. Denne protokol er bredt anvendelig til måling af interaktionsdynamikken for ethvert protein, der deltager i LLPS.

Introduction

En voksende mængde arbejde tyder på, at biomolekylære kondensater spiller en vigtig rolle i cellulær organisation og adskillige cellulære funktioner, fx transkriptionel regulering 1,2,3,4,5, reparation af DNA-skader 6,7,8, kromatinorganisation 9,10,11,12, X-kromosom inaktivering 13,14,15 og intracellulær signalering 16,17,18. Derudover er dysreguleringen af biomolekylære kondensater impliceret i mange sygdomme, herunder kræft 19,20,21 og neurodegenerative lidelser 22,23,24,25,26. Kondensatdannelse drives ofte af forbigående, selektive og multivalente protein-protein-, protein-nukleinsyre eller nukleinsyre-nukleinsyreinteraktioner27. Under visse betingelser kan disse interaktioner føre til væske-væskefaseseparation (LLPS), en densitetsovergang, der lokalt beriger specifikke biomolekyler i membranløse dråber. Sådanne multivalente interaktioner medieres ofte af de iboende uordnede regioner (IDR'er) af proteiner 1,28,29. Biofysisk karakterisering af disse interaktioner på molekylært niveau er afgørende for vores forståelse af adskillige sunde og afvigende cellulære funktioner i betragtning af kondensaternes gennemtrængningsevne på tværs af dem. Selvom teknikker baseret på konfokal fluorescensmikroskopi, f.eks. fluorescensgenvinding efter fotoblegning (FRAP)30,31,32, i vid udstrækning er blevet anvendt til kvalitativt at vise, at de molekylære udvekslinger mellem kondensater og det omgivende cellulære miljø er dynamiske, er det generelt ikke muligt at kvantificere interaktionsdynamikken mellem specifikke biomolekyler inden for kondensater ved anvendelse af konventionel konfokalmikroskopi eller enkeltmolekyle mikroskopi uden specialiserede dataanalysemetoder. Enkeltpartikelsporingsteknikken (SPT) beskrevet i denne protokol er baseret på levende celle enkeltmolekylemikroskopi33 og giver et unikt kraftfuldt værktøj til at kvantificere interaktionsdynamikken mellem specifikke proteiner i kondensater. Udlæsningen af SPT til en sådan måling er den gennemsnitlige opholdstid for et protein af interesse for kondensaterne.

Protokollen kan opdeles i to dele - dataindsamling og dataanalyse. Det første trin i indsamling af billeddata er at udtrykke et protein af interesse i celler, der er smeltet sammen med et HaloTag34. Dette muliggør mærkning af proteinet af interesse med to fluoroforer, hvor et flertal af proteinmolekylerne skal mærkes med en ikke-fotoaktiverbar fluorofor (f.eks. JFX549 Halo ligand35), og en lille brøkdel af dem skal mærkes med en spektralt tydelig, fotoaktiverbar fluorofor (f.eks. PA-JF646 Halo ligand36). Dette muliggør samtidig erhvervelse af alle kondensatplaceringer i cellen og erhvervelse af enkeltmolekylefilm af proteinet af interesse, der binder og afbinder til kondensaterne. I mellemtiden modificeres den samme type celler til stabilt at udtrykke Halo-mærket H2B, en histon, der stort set er immobil på kromatin. Cellerne farves derefter med PA-JF646 Halo-liganden for at muliggøre enkeltmolekylebilleddannelse af H2B. Som det vil blive diskuteret detaljeret nedenfor, tegner dette eksperiment sig for fotoblegningens bidrag til at muliggøre præcis kvantificering af interaktionsdynamikken for proteinet af interesse. Celler til billeddannelseseksperimenter skal derefter dyrkes på rene dæksedler, farves med HaloTag-ligand(er) og samles i et levende cellebilleddannelseskammer. Derfra afbildes prøven under stærkt skrånende og lamineret optisk ark (HILO) belysning på et Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) mikroskop, der er i stand til tokanals billeddannelse og enkeltmolekyledetektion. Emissionen opdeles derefter på to kameraer, et sporingskondensatpositioner og et sporingsenkelt molekyle. Erhvervelse udføres med en lang integrationstid (i størrelsesordenen hundreder af ms) for at sløre frit diffunderende proteiner og kun fange proteiner, der er mindre mobile på grund af binding til stabile strukturer i cellen37.

Det første trin i dataanalyse er at bruge en etableret enkeltpartikelsporingsalgoritme (SPT)38,39 til at lokalisere individuelle proteinmolekyler i hvert billede af filmen og samle lokaliseringerne i en bane for hvert molekyle i løbet af dets detekterbare levetid. Banerne sorteres derefter i dem, der repræsenterer molekyler indeni, og dem, der repræsenterer molekyler uden for kondensaterne ved at sammenligne lokaliseringerne af molekylerne gennem deres baner med lokaliseringerne af alle kondensaterne på de tilsvarende tidspunkter1.

Dernæst genereres en overlevelseskurve (1 - CDF) ved hjælp af længderne af alle in-kondensatbanerne. Molekylernes tilsyneladende gennemsnitlige opholdstid ekstraheres derefter ved at tilpasse overlevelseskurven til følgende to-komponent eksponentielle model for proteinbinding:

Equation 1,

med A som fraktion af molekyler, der ikke er specifikt bundet, og med kobs,ns og kobs,s som de observerede dissociationshastigheder for henholdsvis de ikke-specifikt bundne og specifikt bundne molekyler. Kun kobs,s betragtes herfra. Dynamikken i både proteindissociation, ktrue,s og fotoblegning af fluoroforen, kpb, bidrager til kobs,s som

Equation 2;

For at isolere virkningerne af proteindissociation måles således den specifikke dissociationshastighed for H2B-Halo i den tidligere nævnte cellelinje.

Equation 3

H2B er et protein, der er stabilt integreret i kromatin, og som oplever minimal dissociation i tidsskalaen for en enkeltmolekyle filmoptagelse37. Dens specifikke dissociationshastighed er derefter lig med fotoblegningshastigheden for PA-JF646 Halo-liganden, eller

Equation 4.

Den gennemsnitlige opholdstid i kondensat for det pågældende protein, Equation 5, er derefter

Equation 6.

Repræsentative resultater fra Irgen-Gioro et al.40 vises, hvor denne protokol blev anvendt til at demonstrere, at sammensmeltning af et oligomeriseringsdomæne med IDR resulterer i længere opholdstid for IDR i dens kondensater. Dette resultat antyder, at det tilføjede oligomeriseringsdomæne stabiliserer de homotypiske interaktioner mellem IDR, der driver LLPS. I princippet kan den samme metode med let modificerede protokoller anvendes til at karakterisere de homotypiske eller heterotypiske interaktioner af ethvert protein, der deltager i dannelsen af enhver form for kondensater.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Mærkning af proteiner i celler

  1. Udtryk proteinet af interesse smeltet sammen med HaloTag i den ønskede cellelinje.
  2. Stabilt udtrykke Halo-tagget H2B i samme type celler som i 1.1 ved hjælp af transposoner eller viral transduktion.

2. Udarbejdelse af dæksedler

  1. Før du bruger dæksedler til cellekultur, skal du rengøre dæksedler for at fjerne autofluorescerende forurenende stoffer.
    1. Monter 25 mm diameter, #1.5 dæksler på en keramisk farvningsrist og læg dem i en polypropylenbeholder.
    2. Helt nedsænk dæksler i en 1 M opløsning af KOH og sonikere i 1 time.
    3. Skyl dækslerne tre gange med dobbeltdestilleret vand (ddH2O).
    4. Helt nedsænk dæksler i 100% ethanol og soniker i 1 time.
    5. Dækslerne nedsænkes helt i 20 % ethanol fortyndet med ddH2O, og de opbevares ved 4 °C indtil brug.

3. Forberedelse af celler til mikroskopi

BEMÆRK: Udfør trin fra dette afsnit i et biosikkerhedsskab for at forhindre kontaminering af cellerne.

  1. Pladeceller på rensede dæksedler. Udfør 2 dage før billeddannelse, hvis det halo-mærkede protein skal udtrykkes forbigående. Udfør 1 dag før billeddannelse, hvis det halo-mærkede protein udtrykkes stabilt eller endogent.
    1. Brug sterile tang til at placere dæksler i en 6-brønds plade (en dæksel / brønd pr. Celleprøve) og lad resterende ethanol fordampe.
    2. Plade hver brønd med et passende antal celler for at opnå 70% sammenløb på billeddannelsestidspunktet. Plade en ekstra brønd med celler, der stabilt udtrykker H2B-Halo med samme målsammenløb.
    3. Følg kun dette trin, hvis det forbigående udtrykker det Halo-mærkede protein af interesse. Inkuber celler i 24 timer ved 37 °C og 5% CO2. Derefter transfekteres cellerne med plasmidet, der koder for det mærkede protein af interesse ved hjælp af passende transfektionsreagenser og følger producentens retningslinjer.
    4. Cellerne inkuberes i 24 timer ved 37 °C og 5 % CO2.
  2. Plet cellerne, der udtrykker det Halo-mærkede protein af interesse, med både en ikke-fotoaktiverbar Halo-ligand (f.eks. JFX549) og en fotoaktiverbar Halo-ligand (f.eks. PA-JF646). Pletceller, der udtrykker H2B-Halo med kun den fotoaktiverbare Halo-ligand.
    BEMÆRK: Koncentrationer af halo-ligander, der er anført her, skal bruges som udgangspunkt; Den optimale koncentration afhænger af ekspressionsniveauet og den lokale koncentration i kondensat af proteinet af interesse.
    1. For hver celleprøve, der udtrykker det pågældende halomærkede protein, fortyndes 100 nM JFX549 Halo ligand35 og 20 nM PA-JF646 Halo ligand36 i 500 μL passende cellemedier. For hver prøve, der udtrykker H2B-Halo, fortyndes kun 20 nM PA-JF646 Halo-ligand i 500 μL passende cellemedier.
    2. For hver brønd skal du aspirere eksisterende medier, tilføje 2 ml 1x PBS, derefter aspirere PBS (dette kaldes en "skylning" for resten af protokollen) og erstatte med medier, der indeholder de relevante Halo-ligander.
    3. Der inkuberes i 1 time ved 37 °C og 5 % CO2.
    4. Skyl med PBS fire gange og udskift med friske medier, der ikke indeholder Halo-ligander.
    5. Der inkuberes i 15 minutter ved 37 °C og 5% CO2.
    6. Trin 3.2.4 og 3.2.5 gentages tre gange (fire skylleinkubationscyklusser i alt).
    7. Brug sterile tang til at overføre dæksedlen med celler til et cellekulturdækselkammer, der er kompatibelt med mikroskoptrinnet.
    8. Tilsæt phenol rødfrie medier til kammeret og fortsæt til billeddannelse. Prøverne, der ikke straks tages ud af billedet, inkuberes ved 37 °C og 5 % CO2 , indtil de skal bruges.

4. Billeddannelse af enkeltmolekyle

BEMÆRK: Uafhængige eksperimenter, der måler opholdstiden for både H2B og proteinet af interesse, bør udføres over flere (≥3) dage for at generere statistisk signifikante resultater. Før du afbilder celleprøver på mikroskopet, skal du justere de to kameraer ved hjælp af 0,1 μm farvede mikrosfærer (materialefortegnelse) eller en lignende kalibreringsstandard.

  1. Forbered mikroskopet.
    1. Tænd mikroskopet og computeren, der styrer mikroskopet.
    2. Tænd for levende celleinkubationskomponenter (varmelegeme og CO2) på mikroskopet, og indstil det til 37 ° C og 5% CO2. Lad systemet balancere.
    3. Sæt en dråbe af den passende olie på et 100x TIRF olienedsænkningsmål på mikroskopet og læg celleprøven på mikroskopstadiet.
  2. Identificer en celle til billede.
    1. Tag billeder af celleprøven under brightfield-belysning, og juster z-positionen, indtil cellerne er i fokus.
    2. Identificer en celle, der udviser morfologiske egenskaber ved sunde celler.
    3. Beskær synsfeltet (FOV), så det kun fanger målcellekernen.
    4. Brug laserbelysning og juster TIRF-vinklen, indtil HILO belysning41 med optimalt signal-støj-forhold mellem enkeltmolekyler er opnået.
  3. Billede H2B-Halo i levende celler.
    BEMÆRK: De laserkræfter, der bruges i dette afsnit, er specifikke for dette eksperiment og medtaget som et eksempel. Passende laserkræfter bør vælges i henhold til de kriterier, der er anført i diskussionen.
    1. Konfigurer en anskaffelseskonfiguration på følgende måde. Indstil eksponeringstiden til 500 ms. Under hver 500 ms eksponering exciteres PA-JF646 mærket H2B-Halo-molekyler med en 9,1 mW, 640 nm stråle. I løbet af dødtiden mellem rammer (158,01 μs på billeddannelsessystemet, der anvendes her), fotoaktiver molekylerne med en 111 μW, 405 nm stråle.
    2. Optag 2000 billeder kontinuerligt under disse indstillinger. Gradvist øge 405 nm strålens effekt i løbet af erhvervelsen, når antallet af fotoaktiverede molekyler bliver utilstrækkeligt.
  4. Forestil dig det Halo-mærkede protein af interesse i levende celler.
    1. Brug et dikroisk spejl med lang passage til at opdele emissionsbølgelængder mellem to kameraer, det ene til at detektere PA-JF646 og det andet til at detektere JFX549. Brug passende emissionsfiltre foran kameraerne.
    2. Brug den samme anskaffelseskonfiguration som beskrevet i 4.3.1 med følgende ændring. Tilføj en ekstra JFX549-kanal for at spore placeringen af de Halo-mærkede proteinkondensater over tid. Hver 10. sek. erhverver du en ramme (500 ms, 2,1 mW, 561 nm excitation) i JFX549-kanalen, mens du beholder erhvervelsen af PA-JF646-kanalen. Dette vil medføre gennemblødning i PA-JF646-kanalen, som der vil blive taget hånd om i dataanalysen efter erhvervelsen.
    3. Optag 2000 billeder kontinuerligt under disse indstillinger. Gradvist øge 405 nm strålens effekt i løbet af erhvervelsen, når antallet af fotoaktiverede molekyler bliver utilstrækkeligt.

5. Analyse af enkeltmolekylebilleddata

BEMÆRK: De parametre, der anvendes i afsnit 5, er specifikke for dette eksperiment og medtaget som et eksempel. Passende parametre bør vælges i overensstemmelse med de kriterier, der er anført i diskussionen.

  1. Forbered rå billeddata til behandling.
    1. For dataene for proteinet af interesse skal du konvertere hver kanal fra den rå billeddatafil til en uafhængig .tif fil ved hjælp af ImageJ eller lignende billedbehandlingssoftware. For dataene i H2B skal du konvertere den enkelte kanal fra den rå billeddatafil til en .tif fil på samme måde.
      BEMÆRK: Afhængigt af den anvendte anskaffelsessoftware kan der være tomme billeder i kondensatfilmen, da der kun tages en kondensatsporingsramme hver 10. sekund. De tomme rammer skal udfyldes med den nyeste kondensatramme (noget anskaffelsessoftware gør automatisk dette). Hvis der desuden er betydelig gennemblødning fra kondensatkanalen (JFX549) til enkeltmolekylekanalen (PA-JF646) under disse kondensatsporingsrammer, skal de tilsvarende enkeltmolekylerammer udskiftes med den seneste enkeltmolekyleramme.
    2. Hvis der er billeder, der skal udskiftes i en af filmene på grund af ovenstående årsager, skal du erstatte dem med det seneste billede fra den pågældende film ved at ændre (om nødvendigt) og køre pretracking_comb.txt, en ImageJ-makro, der er tilgængelig i Chong et al.1, og følge vejledningen.
  2. Generer enkeltpartikelbaner ved hjælp af en SPT-software, f.eks. SLIMfast39, en GUI-implementering af MTT-algoritmen38 , der er tilgængelig i Teves et al.42.
    1. Indlæs filen fra 5.1.2, der indeholder enkeltmolekylefilmen i SLIMfast ved at klikke på Indlæs > Imagestack.
    2. Indstil parametrene (lokaliseringsfejlrate: 10-6; deflationssløjfer: 3) til lokalisering ved at klikke på OPT > Ark: Lokalisering.
    3. Indstil parametrene (maksimal emission: 664 nm; forsinkelsestid: 500 ms) for anskaffelse ved at klikke på OPT > Ark: Anskaffelse.
    4. Visualiser lokaliseringerne af alle molekylerne i en enkelt ramme for at sikre, at de valgte parametre er passende (TEST LOC). Hvis det ikke er hensigtsmæssigt, skal du ændre parametrene i trin 5.2.2 og 5.2.3 og gentage dette trin.
    5. Generer en fil, der indeholder lokaliseringerne af alle molekylerne i hver ramme (LOC ALL).
    6. Indlæs filen fra 5.2.5 i SLIMfast ved at klikke på Indlæs > partikeldata > SLIMfast.
    7. Indstil parametrene (maksimal forventet diffusionskoefficient: 0,1 μm2/s; maksimalt antal konkurrenter: 5) til banegenerering ved at klikke på OPT > Sheet: Tracking.
    8. Generer en fil, der indeholder banerne for alle molekylerne (GEN TRAJ).
  3. Filtrer de baner, der er kortere end tmin, 2,5 s, ved hjælp af evalSPT39, der er tilgængelig i Drosopoulos et al.43, for at tage højde for sporingsfejl, der resulterer i kunstigt korte baner.
    1. Indlæs filen fra 5.2.8 til evalSPT (+ > fil fra 5.2.8 > OK).
    2. Indstil parametrene (min: 5 billeder; max: maksimal banelængde for fil fra 5.2.8) for at filtrere banerne kortere end 2,5 s.
    3. Generer en fil med alle de filtrerede baner (EKSPORTDATA).
  4. Følg dette trin for banerne for proteinet af interesse alene. Sorter banerne i dem i kondensaterne og ud af kondensaterne, og ekstraher derefter den gennemsnitlige opholdstid i kondensat.
    BEMÆRK: Alle koder for dette afsnit er tilgængelige i Chong et al.1.
    1. Tærsk, alle billeder i filmen, der er hentet i JFX549-kanalen, for at generere en timelapse-film befolket med den tidsudviklende binære maske, der fremhæver kondensatplaceringer ved at køre ImageJ-makroen, kernen og klyngen mask_v2.txt og følge vejledningen.
    2. Omformater de enkeltmolekylebaner, der genereres i 5.3.3. ved hjælp af MATLAB-scriptet ConvertASCII_SlowTracking_css3.m og justering af filnavne, stier og parametre efter behov. (Parametre: Eksponering, 0,5 s; Opløsning, 0,16 μm/pixel).
    3. Sorter baner baseret på den brøkdel af levetiden, et givet molekyle bruger i et kondensat, F, ved hjælp af MATLAB-scriptet categorization_v4.m, og juster filnavne og stier efter behov.
    4. Fortsæt kun ved hjælp af kondensatbaner.
  5. Udtræk kobs,s og kpb og beregn den korrigerede gennemsnitlige opholdstid, Equation 6.
    1. Uddrag kobs,s fra in-kondensatproteinet af interessebaner ved hjælp af MATLAB-scriptet, PLOT_ResidenceHist_css.m, og juster filnavne, stier og parametre efter behov.
      (Parametre: Eksponering, 0,5 s; StartFrameForFit, 5 rammer).
    2. Uddrag kpb fra H2B-banerne ved hjælp af MATLAB-scriptet, PLOT_ResidenceHist_css.m, og juster filnavne, stier og parametre efter behov.
      (Parametre: Eksponering, 0,5 s; StartFrameForFit, 5 rammer).
    3. Beregn den korrigerede gennemsnitlige opholdstid for det pågældende protein, der specifikt er bundet til dets kondensater, Equation 6som
      Equation 7
      BEMÆRK: Der bør udføres kontroller for at verificere, at forskellige eksponeringstider, der er lange nok til at sløre mobile partikler, for eksempel 300 ms og 800 ms, stadig resulterer i den samme gennemsnitlige opholdstid for det pågældende protein.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Her præsenterer vi repræsentative resultater fra Irgen-Gioro et al.40, hvor vi brugte denne SPT-protokol til at sammenligne interaktionsdynamikken mellem to proteiner i deres respektive selvsamlede LLPS-kondensater. TAF15 (TATA-box bindende protein associeret faktor 15) indeholder en IDR, der kan gennemgå LLPS ved overekspression i humane celler. Vi antog, at sammensmeltning af TAF15 (IDR) til FTH1 (ferritin tung kæde 1), som danner en 24-underenhed oligomer, ville føre til mere stabile homotypiske protein-proteininteraktioner, der driver LLPS. For at teste denne hypotese udtrykte vi forbigående i U2OS-celler enten Halo-TAF15 (IDR) eller TAF15 (IDR) -Halo-FTH1-fusion og udførte tofarvet enkeltmolekylebilleddannelse af hvert protein efter ovenstående protokol. En repræsentativ ramme fra en TAF15(IDR)-Halo-FTH1-film er vist i figur 1A. Molekyler detekteret i PA-JF646-kanalen blev lokaliseret, og disse lokaliseringer blev samlet i baner. De resulterende baner blev derefter sorteret mellem populationer i kondensat og uden for kondensat ved sammenligning med en binær maske, der fremhævede kondensatplaceringer (figur 1B). Mens vi kun viser en lille brøkdel af banerne for god synlighed, er der en klar sondring mellem banerne af molekyler bundet til kondensaterne og bundet uden for kondensaterne. Dernæst blev en overlevelseskurve for in-kondensatbanelængder monteret mod den to-komponent eksponentielle model (figur 1C). Endelig blev gennemsnitlige opholdstider efter korrektion for fotoblegning ekstraheret og plottet for begge proteiner (figur 1D). Vi fandt, at den gennemsnitlige opholdstid for Halo-TAF15 (IDR) i dets LLPS-kondensater var 10.23 s ± 1.10 s, mens TAF15 (IDR) -Halo-FTH1 var 64.15 s ± 11.65 s. Dette resultat antyder, at tilføjelsen af det oligomeriserende domæne til TAF15 (IDR) faktisk stabiliserer proteinkondensatbindingen.

Figure 1
Figur 1: SPT-baseret metode løser forskelle i opholdstiden for proteiner i deres kondensater. A. Repræsentative billeder fra en tofarvet enkeltmolekylefilm af TAF15(IDR)-Halo-FTH1. Proteiner blev mærket med en kombination af en højere koncentration af ikke-fotoaktiverbart farvestof (100 nM JFX549, gul) for at visualisere placeringen af kondensater og en lavere koncentration af fotoaktiverbart farvestof (20 nM PA-JF646, magenta) for at visualisere individuelle proteiner, hvilket muliggør SPT. Film under de samme billedbehandlingsbetingelser blev erhvervet til Halo-TAF15 (IDR) og enkeltkanals, PA-JF646-film blev erhvervet til H2B-Halo. En hvid stiplet linje skitserer kernen. B. Repræsentativt fusioneret billede overlejret en binær maske af kondensatposition (grå) og baner (flerfarvet). C. Repræsentativ overlevelseskurve for TAF15(IDR)-Halo-FTH1 udstyret med den tokomponentede eksponentielle model. D. Den gennemsnitlige opholdstid for Halo-TAF15 i var signifikant kortere end for TAF15(IDR)-Halo-FTH1 i deres respektive kondensater. Værdien for hvert protein blev beregnet som gennemsnit fra 20 celler målt i uafhængige eksperimenter udført over tre dage. Fejl blev udbredt som standardfejl i middelværdien, og stjernen repræsenterer en signifikant forskel i opholdstiden for de to proteiner (p<0,05, Wilcoxon rangsumstest). Denne figur er tilpasset med tilladelse fra Irgen-Gioro et al.40. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollen, som den præsenteres her, er designet til systemer som dem, der er undersøgt i Irgen-Gioro et al.40. Afhængigt af applikationen kan nogle komponenter i protokollen ændres, f.eks. metoden til generering af fluorescerende mærkede cellelinjer, det fluorescerende mærkningssystem og den anvendte stil med coverslip. Halo-tagging af et protein i en celle kan udføres ved hjælp af to strategier, afhængigt af hvilken der er mere egnet til et givet eksperiment. 1) Eksogent udtryk: sammensmeltning af proteinet af interesse for et HaloTag og ekspression af fusionen i en målcellelinje enten forbigående ved hjælp af transfektion eller stabilt ved hjælp af transposoner eller viral transduktion. 2) Genomredigering: bank et HaloTag ind på genstedet, der koder for det endogene protein af interesse i en målcellelinje ved hjælp af genomredigeringsteknikker, f.eks. CRISPR44. Fordele og ulemper ved hver diskuteres andetsteds45, men kort fortalt er den eksogene ekspressionsstrategi mindre tidskrævende, men producerer en population af celler med en bred vifte af ekspressionsniveauer, der ofte er ikke-fysiologiske. Genomredigeringsstrategien tager meget længere tid, men mærker endogent udtrykte proteiner af interesse på deres oprindelige ekspressionsniveauer.

Derudover kræver denne protokol ikke specifikt brug af et HaloTag; Det er snarere kompatibelt med ethvert tag, der muliggør samtidig enkeltmolekyle- og ensemblemærkning af det samme protein i cellen. Således kan protokollen ændres til brug med andre selvmærkningsmærker som SNAP-tag46. Endelig kan forrensede, kommercielle glasbundede skåle til cellekultur, såsom MatTek-skåle (MatTek Life Sciences, P35G-1.5-20-C), bruges i stedet for dækslipkamre, forudsat at de er kompatible med mikroskopmålet og nedsænkningsolie; Dæksedler kan dog rengøres grundigere umiddelbart før brug, og er derfor at foretrække.

Mens ovenstående ændringer af protokollen er valgfrie, er der eksperimentelle og analyseparametre, der skal optimeres, nemlig koncentrationerne af HaloTag-ligander, laserkræfterne, lokaliserings- og sporingsparametrene og tmin. Koncentrationen af den ikke-fotoaktiverbare HaloTag-ligand skal vælges således, at kondensatet mærkes tæt nok til at muliggøre maskegenerering. Koncentrationen af den fotoaktiverbare HaloTag-ligand og fotoaktiveringslasereffekten skal vælges således, at proteinmolekyler mærkes og fotoaktiveres sparsomt nok til at generere enkeltpartikelbaner af høj kvalitet, da et overskud af lokaliseringer i hver ramme vil resultere i unøjagtig banegenerering. For eksperimenter vist i de repræsentative resultater var der generelt færre end fem lokaliseringer pr. Ramme. Excitationslasereffekten skal holdes lav nok til at minimere hurtig fotoblegning, men høj nok til at lokalisere enkeltmolekyler præcist. Enkeltmolekylelokaliserings- og sporingsparametrene bør justeres afhængigt af excitationstætheden og den forventede diffusionsdynamik af proteinet af interesse. Endelig bør værdierne af Equation 6 beregnes over et interval af tmin (startende fra 0 s og stigende i trin af eksponeringstid). Værdierne af Equation 6 bør konvergere over en vis tærskel på tmin; denne tmin skal anvendes i trin 5.3.

Den her skitserede metode kvantificerer proteiners interaktionsdynamik i kondensater med en præcision, der er utilgængelig for konventionelle teknikker. Derudover kan det gøre det i levende celler med minimal prøveforstyrrelse. Dette er kritisk, da interaktionsadfærden hos dybdegående undersøgelser, herunder deres kondensatdannelse, er stærkt afhængig af deres lokale miljø40.

De repræsentative resultater fra Irgen-Gioro et al.40 demonstrerer denne metodes evne til at ekstrahere opholdstider for proteiner, der binder til deres selvsamlede LLPS-kondensater. Det er vigtigt, at denne metode let kan udvides til enhver proteinbinding til enhver form for kondensater gennem homotypiske eller heterotypiske interaktioner. Desuden er det ikke begrænset til at måle interaktionsdynamikken hos proteiner, der gennemgår LLPS. Fusionsonkoproteinet EWS::FLI1, som vides at forårsage Ewing-sarkom, har vist sig at danne lokale knudepunkter med høj koncentration, der spiller en væsentlig rolle i dets transkriptionelle aktivering og onkogene transformationsfunktioner 1,2. Mens dannelsen af disse hubs er drevet af forbigående, selektive og multivalente IDR-IDR-interaktioner mellem EWS::FLI1, er der indtil videre stadig ingen overbevisende beviser for, at de er bona fide LLPS-kondensater 1,2. Alligevel brugte vi den metode, der præsenteres her, til at måle den gennemsnitlige opholdstid for EWS::FLI1 ved dens nav og viste, at mutationen af specifikke rester og sletningen af dens IDR signifikant destabiliserede bindingen af EWS::FLI1 til dens nav1.

På trods af denne metodes alsidighed til at karakterisere proteinernes bindingsdynamik i kondensater, bør der udvises forsigtighed, når man vælger modellen for proteinbinding i specifikke sammenhænge. Eksisterende biokemiske data understøtter ideen om, at en to-komponent eksponentiel fordeling ofte er en passende model for mange systemer 1,37,40,42, men den samme fordeling har også vist sig at være en uhensigtsmæssig repræsentation af proteinbinding i andre systemer, hvor alternative modeller såsom trekomponent eksponentiel 47,48,49 og effektlovfordelinger 50 bedre matche de eksperimentelle observationer. For at undgå at drage unøjagtige konklusioner bør man omhyggeligt vælge og motivere en model, kontrollere, at kvaliteten af pasformen understøtter brugen af modellen og omhyggeligt fortolke resultaterne.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af National Science Foundation Graduate Research Fellowship under bevilling nr. DGE-1745301 (S.Y.), Pew-Stewart Scholar Award (S.C.), Searle Scholar Award (S.C.), Shurl og Kay Curci Foundation Research Grant (S.C.), Merkin Innovation Seed Grant (S.C.), Mallinckrodt Research Grant (S.C.) og Margaret E. Early Medical Research Trust 2024-bevilling (S.C.). S.C. støttes også af NIH/NCI under tildelingsnummer P30CA016042.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1 µm TetraSpeck microsphere Invitrogen T7279 Single-molecule imaging
25 mm Diameter, #1.5 Coverslips Marienfeld Superior 111650 Preparation of coverslips
593/40 nm bandpass filter Semrock FF01-593/40-25 Single-molecule imaging
676/37 nm bandpass filter Semrock FF01-676/37-25 Single-molecule imaging
6-Well TC Plate Genesee 25-105MP Preparation of cells for microscopy
Cell Line: U-2 OS ATCC HTB-96 Labeling of proteins in cells
ConvertASCII_SlowTracking_css3
.m		 Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018
Coverglass Staining Rack Thomas 24957 Preparation of coverslips
Deuterated Janelia Fluor 549 (JFX549) Janelia Research Campus Preparation of cells for microscopy
DMEM, Low Glucose Gibco 10-567-022 Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep
Eclipse Ti2-E Inverted Microscope Nikon Single-molecule imaging
Ethanol 200 Proof Lab Alley EAP200-1GAL Preparation of coverslips
evalSPT Analysis of single-molecule imaging data: Available in Drosopoulos et al., 2020
Fetal Bovine Serum Cytiva SH30396.03 Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep
Fiji Analysis of single-molecule imaging data
Ikon Ultra CCD Camera Andor X-13723 Single-molecule imaging
Longpass dichroic beamsplitter Semrock Di02-R635-25x36 Single-molecule imaging: Red/Far Red beamsplitter
LUN-F Laser Unit Nikon Single-molecule imaging: 405/488/561/640
MatTek glass-bottom dish MatTek P35G-1.5-20-C Preparation of cells for microscopy: 35 mm, #1.5 coverslip dish for cell culture.
NIS-Elements Nikon Single-molecule imaging: Microscope acquisition software
nucleus and cluster mask_v2.txt Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018
Penicillin-Streptomycin Gibco 15-140-122 Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep
Phosphate Buffered Saline Thermo Fisher Scientific 18912014 Labeling of proteins in cells
Photoactivatable Janelia Fluor 646 (PA-JF646) Janelia Research Campus Preparation of cells for microscopy
PLOT_ResidenceHist_css.m Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018
Potassium Hydroxide Mallinckrodt Chemicals 6984-06 Preparation of coverslips
pretracking_comb.txt Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018
SLIMfast Analysis of single-molecule imaging data: Available in Teves et al., 2016
Stage-top incubation system Tokai Hit Single-molecule imaging: For live-cell imaging
TwinCam dual emission image splitter Cairn Research Single-molecule imaging
Ultrasonic Cleaner Branson 5800 Preparation of coverslips

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chong, S., et al. Imaging dynamic and selective low-complexity domain interactions that control gene transcription. Science. 361 (6400), (2018).
  2. Chong, S., Graham, T. G. W., Dugast-Darzacq, C., Dailey, G. M., Darzacq, X., Tjian, R. Tuning levels of low-complexity domain interactions to modulate endogenous oncogenic transcription. Molecular Cell. 82 (11), 2084-2097 (2022).
  3. Boehning, M., et al. RNA polymerase II clustering through carboxy-terminal domain phase separation. Nature Structural & Molecular Biology. 25 (9), 833-840 (2018).
  4. Sabari, B. R., et al. Coactivator condensation at super-enhancers links phase separation and gene control. Science. 361 (6400), New York, N.Y. (2018).
  5. Boija, A., et al. Transcription factors activate genes through the phase-separation capacity of their activation domains. Cell. 175 (7), 1842-1855 (2018).
  6. Levone, B. R., et al. FUS-dependent liquid-liquid phase separation is important for DNA repair initiation. Journal of Cell Biology. 220 (5), e202008030 (2021).
  7. Kilic, S., et al. Phase separation of 53BP1 determines liquid-like behavior of DNA repair compartments. The EMBO Journal. 38 (16), e101379 (2019).
  8. Pessina, F., et al. Functional transcription promoters at DNA double-strand breaks mediate RNA-driven phase separation of damage-response factors. Nature Cell Biology. 21 (10), 1286-1299 (2019).
  9. Nozaki, T., et al. Condensed but liquid-like domain organization of active chromatin regions in living human cells. Science Advances. 9 (14), (2023).
  10. Maeshima, K., et al. Nucleosomal arrays self-assemble into supramolecular globular structures lacking 30-nm fibers. The EMBO Journal. 35 (10), 1115-1132 (2016).
  11. Strickfaden, H., Tolsma, T. O., Sharma, A., Underhill, D. A., Hansen, J. C., Hendzel, M. J. Condensed chromatin behaves like a solid on the mesoscale in vitro and in living cells. Cell. 183 (7), 1772-1784 (2020).
  12. Gibson, B. A., et al. Organization of chromatin by intrinsic and regulated phase separation. Cell. 179 (2), 470-484 (2019).
  13. Cerase, A., Armaos, A., Neumayer, C., Avner, P., Guttman, M., Tartaglia, G. G. Phase separation drives X-chromosome inactivation: a hypothesis. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (5), 331-334 (2019).
  14. Jachowicz, J. W., Strehle, M., Banerjee, A. K., Blanco, M. R., Thai, J., Guttman, M. Xist spatially amplifies SHARP/SPEN recruitment to balance chromosome-wide silencing and specificity to the X chromosome. Nature Structural & Molecular Biology. 29 (3), 239-249 (2022).
  15. Pandya-Jones, A., et al. A protein assembly mediates Xist localization and gene silencing. Nature. 587 (7832), 145-151 (2020).
  16. Du, M., Chen, Z. J. DNA-induced liquid phase condensation of cGAS activates innate immune signaling. Science. 361 (6403), 704-709 (2018).
  17. Zamudio, A. V., et al. Mediator condensates localize signaling factors to key cell identity genes. Molecular Cell. 76 (5), 753-766 (2019).
  18. Zhang, J. Z., et al. Phase separation of a PKA regulatory subunit controls cAMP compartmentation and oncogenic signaling. Cell. 182 (6), 1531-1544 (2020).
  19. Kovar, H. Dr. Jekyll and Mr. Hyde: The two faces of the FUS/EWS/TAF15 protein family. Sarcoma. 2011, e837474 (2010).
  20. Linardic, C. M. PAX3-FOXO1 fusion gene in rhabdomyosarcoma. Cancer Letters. 270 (1), 10-18 (2008).
  21. Ahn, J. H., et al. Phase separation drives aberrant chromatin looping and cancer development. Nature. 595 (7868), 591-595 (2021).
  22. Wegmann, S., et al. Tau protein liquid-liquid phase separation can initiate tau aggregation. The EMBO Journal. 37 (7), e98049 (2018).
  23. Friedman, M. J., et al. Polyglutamine domain modulates the TBP-TFIIB interaction: implications for its normal function and neurodegeneration. Nature Neuroscience. 10 (12), 1519-1528 (2007).
  24. Molliex, A., et al. Phase separation by low complexity domains promotes stress granule assembly and drives pathological fibrillization. Cell. 163 (1), 123-133 (2015).
  25. Murakami, T., et al. ALS/FTD mutation-induced phase transition of FUS liquid Droplets and reversible hydrogels into irreversible hydrogels impairs RNP granule function. Neuron. 88 (4), 678-690 (2015).
  26. Patel, A., et al. A liquid-to-solid phase transition of the ALS protein FUS accelerated by disease mutation. Cell. 162 (5), 1066-1077 (2015).
  27. Shin, Y., Brangwynne, C. P. Liquid phase condensation in cell physiology and disease. Science. 357 (6357), (2017).
  28. Kato, M., McKnight, S. L. A solid-state conceptualization of information transfer from gene to message to protein. Annual Review of Biochemistry. 87, 351-390 (2018).
  29. Li, P., et al. Phase transitions in the assembly of multivalent signalling proteins. Nature. 483 (7389), 336-340 (2012).
  30. Muzzopappa, F., et al. Detecting and quantifying liquid-liquid phase separation in living cells by model-free calibrated half-bleaching. Nature Communications. 13 (1), 7787 (2022).
  31. Sprague, B. L., Müller, F., Pego, R. L., Bungay, P. M., Stavreva, D. A., McNally, J. G. Analysis of binding at a single spatially localized cluster of binding sites by fluorescence recovery after photobleaching. Biophysical Journal. 91 (4), 1169-1191 (2006).
  32. Taylor, N. O., Wei, M. -T., Stone, H. A., Brangwynne, C. P. Quantifying dynamics in phase-separated condensates using fluorescence recovery after photobleaching. Biophysical Journal. 117 (7), 1285-1300 (2019).
  33. Liu, Z., Lavis, L. D., Betzig, E. Imaging live-cell dynamics and structure at the single-molecule level. Molecular Cell. 58 (4), 644-659 (2015).
  34. Los, G. V., et al. HaloTag: A novel protein labeling technology for cell imaging and protein analysis. ACS Chemical Biology. 3 (6), 373-382 (2008).
  35. Grimm, J. B., et al. A general method to improve fluorophores using deuterated auxochromes. JACS Au. 1 (5), 690-696 (2021).
  36. Grimm, J. B., et al. photoactivatable fluorophores for single-molecule imaging. Nature Methods. 13 (12), 985-988 (2016).
  37. Hansen, A. S., Pustova, I., Cattoglio, C., Tjian, R., Darzacq, X. CTCF and cohesin regulate chromatin loop stability with distinct dynamics. eLife. 6, 25776 (2017).
  38. Sergé, A., Bertaux, N., Rigneault, H., Marguet, D. Dynamic multiple-target tracing to probe spatiotemporal cartography of cell membranes. Nature Methods. 5 (8), 687-694 (2008).
  39. Normanno, D., et al. Probing the target search of DNA-binding proteins in mammalian cells using TetR as model searcher. Nature Communications. 6 (1), 7357 (2015).
  40. Irgen-Gioro, S., Yoshida, S., Walling, V., Chong, S. Fixation can change the appearance of phase separation in living cells. eLife. 11, e79903 (2022).
  41. Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells. Nature Methods. 5 (2), 159-161 (2008).
  42. Teves, S. S., An, L., Hansen, A. S., Xie, L., Darzacq, X., Tjian, R. A dynamic mode of mitotic bookmarking by transcription factors. eLife. 5, e22280 (2016).
  43. Drosopoulos, W. C., Vierra, D. A., Kenworthy, C. A., Coleman, R. A., Schildkraut, C. L. Dynamic assembly and disassembly of the human DNA polymerase δ holoenzyme on the genome In vivo. Cell Reports. 30 (5), 1329 (2020).
  44. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), New York, N.Y. 819-823 (2013).
  45. Yoshida, S. R., Maity, B. K., Chong, S. Visualizing protein localizations in fixed cells: Caveats and the underlying mechanisms. The Journal of Physical Chemistry B. 127 (19), 4165-4173 (2023).
  46. Gautier, A., et al. An engineered protein tag for multiprotein labeling in living cells. Chemistry & Biology. 15 (2), 128-136 (2008).
  47. Hipp, L., et al. Single-molecule imaging of the transcription factor SRF reveals prolonged chromatin-binding kinetics upon cell stimulation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (3), 880-889 (2019).
  48. Agarwal, H., Reisser, M., Wortmann, C., Gebhardt, J. C. M. Direct observation of cell-cycle-dependent interactions between CTCF and chromatin. Biophysical Journal. 112 (10), 2051-2055 (2017).
  49. Chen, L., Zhang, Z., Han, Q., Maity, B. K., Rodrigues, L., Zboril, E., Adhikari, R., Ko, S. H., Li, X., Yoshida, S. R., Xue, P., Smith, E., Xu, K., Wang, Q., Huang, T. H., Chong, S., Liu, Z. Hormone-induced enhancer assembly requires an optimal level of hormone receptor multivalent interactions. Molecular cell. 83 (19), 3438-3456 (2023).
  50. Garcia, D. A., et al. Power-law behavior of transcription factor dynamics at the single-molecule level implies a continuum affinity model. Nucleic Acids Research. 49 (12), 6605-6620 (2021).

Tags

Biologi udgave 203 Intrinsically disordered proteiner proteinbindingsdynamik biomolekylære kondensater væske-væskefaseseparation enkeltpartikelsporing fluorescensmikroskopi
Enkeltmolekylemåling af proteininteraktionsdynamik inden for biomolekylære kondensater
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yoshida, S. R., Chong, S.… More

Yoshida, S. R., Chong, S. Single-Molecule Measurement of Protein Interaction Dynamics Within Biomolecular Condensates. J. Vis. Exp. (203), e66169, doi:10.3791/66169 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter