유충 고리 분비선 박리: 초파리에서 발달 내분비 기관의 분리

초록

출처: Imura, E., et al. 초파리 초파리 멜라노가스터에서 면역염색을 통한 스테로이드성 장기 및 상호 작용 기관을 시각화하기 위한 프로토콜. J. Vis. 특급 (2017).

이 동영상은 생합성과 엑디스테로이드 및 기타 호르몬 분비에 중요한 복잡한 내분비 구조인 초파리 고리샘에 대해 설명합니다. 주요 프로토콜은 해부, 고정 및 면역 염색을 보여줍니다.

프로토콜

이 프로토콜은 Imura et al., Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2017)에서 발췌한 것입니다.

참고: 프로토콜의 전체 체계는 그림 1.

1. 유충 고리 땀샘(RG)의 해부

참고: cyclorrhaphous Diptera에 속하는 D. melanogaster에서 PG는 고리샘(RG, 그림 2 D)이라고 하는 복합 내분비 기관 내에 있습니다. PG를 다른 유형의 세포와 외과적으로 분리하는 것은 불가능하기 때문에(나중에 논의) 실용적인 목표는 손상되지 않은 손상되지 않은 RG를 해부하여 분리하는 것입니다.....

결과

그림 1: 프로토콜의 전체 체계. 실험의 목적에 따라 유충과 성체 암컷에 두 가지 뚜렷한 해부 방법이 적용됩니다. 장착 방법도 샘플 조건에 따라 고안됩니다. 고정, 염색 및 이미징 기술은 기본적으로 모든 샘플에 공통적입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: PG와 PG 투영 뉴런의 시각화. (A 및

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
난자 수집
조직 배양 접시 (55mm)	하나로	1-8549-02	포도 주스 한천 플레이트용
제품분류 컵	히카리 가가쿠
효모 페이스트	동양 건조 효모, 도쿄
100% 포도 주스	웰치 푸드 Inc.
유충 사육
소형 바이알(12ml, 40×23.5mm, PS)	사르스테트	58.487
일회용 루프	하나로	6-488-01
표준 플라이 푸드			레시피는 블루밍턴 스톡 센터 웹사이트에 있습니다.
해부
해부 현미경	칼 자이스	스테미 2000-C
해부 현미경	라이카	S8 AP0
조직 배양 접시 (35 x 10mm, 비 처리)	이와키	1000-035
실가드	도레이		접시 안쪽에 Coarting 실리콘
테루모 바늘 (27G, 0.40 x 19mm)	데루모	NN-2719S	조직을 자르는 "칼"
집게, 이녹스, #5	Dumont, 스위스
곤충 핀(직경 0.18mm)	시가 브랜드		필렛 해부용
마이크로 가위	주식회사 나츠메 제작	MB-50-10
고정
초순수	머크 밀리포어
인산염 완충 식염수(PBS)
포름알데히드	나칼라이 테스크	16222-65
파라포름알데히드	나칼라이 테스크	제02890-45
트리톤-X100	나칼라이 테스크	35501-15
마이크로튜브(1.5ml)	이나 옵티카	CF-0150
잠복
1 개의 swist 믹서 TM-300 (로커)	하나로	TM-300	로커
소 세럼 알부민	시그마	9048-46-8
1차 항체
안티 Sro (기니피그), 1:1000
안티 GFP (토끼), 1:1000	분자 프로브	A6455	Shimada-Niwa ans Niwa, 2014
anti-GFP(마우스 mAb, GF200), 1:100	나카라이 테스크	제04363-66
안티-5HT (토끼), 1:500	시그마	S5545
anti-Hts 1B1 (마우스)	발달 연구 하이브리도마 은행(DSHB)	1나1호
안티 DE-cadherin (쥐), 1:20	증권 시세	디케이드2
Anti-NC82 (마우스), 1:50	증권 시세	NC82
2차 항체
염소 anti-Rabbit IgG (H+L) 2차 항체, Alexa Fluor 488 conjugate	생명 기술	A-11008
염소 안티-마우스 IgG (H+L) 2차 항체, Alexa Fluor 488 conjugate	생명 기술	A-11001
염소 anti-Rat IgG (H+L) 2차 항체, Alexa Fluor 546 conjugate	생명 기술	A-11081
Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) 2차 항체, Alexa Fluor 555 conjugate	생명 기술	A-21435
Alexa Fluor 546 염료 접합 팔로이딘	생명 기술	A-22283
마운팅 시약
마이크로 슬라이드 유리	Matsunami Glass 공업 주식회사	SS7213
사각 현미경 커버 유리	Matsunami Glass 공업 주식회사	C218181
FluorSave 시약(장착형 시약)	칼바이오켐	345789
전사 피펫 1 ml (일회용 스포이드)	왓슨	5660-222-1초
플라이 스톡(Fly stocks)
승; GMR45C06-갈4			블루밍턴 초파리 주식 센터에서. (#46260)
UAS-GFP; UAS–mCD8::GFP			도쿄 대학의 K. Ito의 선물.
승[1118]
w; 팬텀-GAL4#22/UAS-turboRFP
승; UAS-mCD8::GFP; TRH-갈4			Li, H. H. (2014) 및 Alekseyenko, O. V, Lee, C. & Kravitz, E. A. (2010)
승; UAS-mCD8::GFP			블루밍턴 초파리 주식 센터에서. (#32188)
yw;; nSyb-GAL4			블루밍턴 초파리 주식 센터에서. (#51941)