Summary
В данной работе представлен протокол производства AAV на основе суспензии HEK293, что приводит к сокращению времени и трудозатрат, необходимых для производства векторов с использованием компонентов, доступных для исследовательских целей у коммерческих поставщиков.
Abstract
Аденоассоциированные вирусные векторы (ААВ) являются замечательным инструментом для исследования центральной нервной системы (ЦНС). Инновационные капсиды, такие как AAV. PHP.eB, демонстрируют обширную трансдукцию ЦНС путем внутривенной инъекции у мышей. Для достижения сопоставимой трансдукции необходим в 100 раз более высокий титр (минимум 1 x 1011 копий генома на мышь) по сравнению с прямой инъекцией в паренхиму ЦНС. В нашей группе производство AAV, в том числе AAV. PHP.eB опирается на адгезивные HEK293T клетки и метод тройной трансфекции. Достижение высоких выходов AAV с адгезивными клетками влечет за собой трудоемкий и материалоемкий процесс. Это ограничение послужило толчком к разработке протокола для суспензионных клеточных культур в конических пробирках. AAV, образующиеся в адгезивных клетках, сравнивали с методом получения суспензии. Сравнивали культуру в суспензии с использованием трансфекционных реагентов Полиэтиленимин или ТрансИт. Векторы AAV очищали с помощью ультрацентрифугирования с градиентом йодиксанола с последующим буферным обменом и концентрированием с использованием центробежного фильтра. С помощью адгезивного метода мы получили в среднем 2,6 x 1012 копий генома (GC), в то время как метод суспензии и полиэтиленимина дал в общей сложности 7,7 x 1012 GC, а TransIt — 2,4 x 1013 GC. Нет различий в эффективности трансдукции in vivo между векторами, полученными с адгезивной системой, по сравнению с системой суспензионных клеток. Таким образом, внедрен протокол производства AAV на основе суспензии HEK293, что приводит к сокращению времени и трудозатрат, необходимых для производства векторов, при достижении в 3-9 раз более высокой производительности при использовании компонентов, доступных у коммерческих поставщиков для исследовательских целей.
Introduction
Аденоассоциированный вирус (AAV) был открыт в 1965 году и с тех пор используется во множествеприложений1. AAV применяются в исследованиях в области неврологии для изучения функций генов и нейронов, картирования нейроцепей или создания животных моделей заболевания2. Традиционно это делается путем инъекции непосредственно в интересующее место, так как большинство естественных серотипов не пересекают гематоэнцефалический барьер и не нуждаются в высокой дозедля этого.
С открытием AAV. PHP.B4 и капсиды следующего поколения, такие как AAV. PHP.eB5 и AAV. CAP-B106, можно воздействовать на центральную нервную систему (ЦНС) с помощью простой системной инъекции. Пространственное сопоставление выявляет ячейки, на которые нацелен AAV. PHP.eB на клеточном уровне 6,7. В сочетании со специфическими промоторами/энхансерами эти капсиды предоставляют нейробиологам широкие возможности для изучения генов и функций мозга путем неинвазивной доставки AAV 4,8.
В то время как для AAV необходима меньшая доза. PHP.eB (обычно от 1 до 5 x 1011 копий генома (GC)/мышь) по сравнению с AAV9 (4 x10 12 GC/мышь)7, требуется еще больше векторов по сравнению со стратегиями прямого введения (обычно 1 x 109 GC/мкл инъекции). Большинство натуральных серотипов могут быть получены с использованием классической адгезивной системы культивирования клеток в сочетании с очисткой йодиксанолом 9,10,11,12. Для AAV. PHP.eB Это влечет за собой трудоемкий процесс культивирования и трансфекции клеток для получения достаточного количества векторов для одного эксперимента8. Поэтому было разработано производство AAV в культуре суспензионных клеток в конических пробирках. Конические пробирки, емкостью до 300 мл, компактны, экономят как место в инкубаторе, так и пластик. Суспензионные клетки гораздо легче культивировать и обрабатывать в больших количествах, чем адгезивные клетки на 15-сантиметровых планшетах. Трансфекционные компоненты протокола остаются прежними. Таким образом, плазмиды, ранее использовавшиеся с адгезивной системой, могут быть легко использованы в этом протоколе, основанном на производстве в суспензионных клетках. Протокол был успешно передан другим исследователям в лаборатории и успешно использован для различных капсидов и конструкций.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все экспериментальные процедуры были одобрены институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию Королевской академии наук Нидерландов (KNAW) и соответствовали голландскому закону об экспериментах на животных в рамках проекта No AVD8010020199126. На рисунке 1 представлен схематический обзор всего протокола. От посева клеток до очистки AAV протокол занимает 6 дней.
1. Приготовление реагента
- Очистка плазмид
- Выполните экстракцию плазмид, как описано производителем, с небольшими корректировками, чтобы обеспечить стерильность плазмид.
- Приготовьте 70% этанол, используя стерильную дистиллированную воду и абсолютный этанол.
- После этапа центрифугирования изопропанола плазмиды высушивают в колпаке проточного шкафа и добавляют в пробирки стерильный 70% этанол. После осаждения этанола высушите плазмиды в колпаке проточного шкафа и повторно суспендируйте плазмиду в стерильной дистиллированной воде. Позаботьтесь о том, чтобы использовать стерилизованные пробирки для микроцентрифуг.
- Возьмите аликвоту для количественного определения, анализа рестрикции и, при необходимости, секвенирования. Рекомендуется проверять целостность инвертированных терминальных повторов (РМЭ), так как мутации могут оказать негативное влияние на урожайность. Отрегулируйте концентрацию образца до 1 мкг/мкл.
- Приготовление 10-кратного буфера для лизиса твина
- Растворите 30,3 г буфера Tris и 2,033 г MgCl2,6H 2O в 400 мл стерильной дистиллированной воды, установите pH 8,0 и увеличьте общий объем до 450 мл.
- Держите Tween 20 стерильным, добавьте 50 мл Tween 20 в буферный раствор в колпаке и стерилизуйте фильтр с помощью вакуум-фильтра 0,2 мкМ.
- Разведения йодиксанола
- Раствор йодиксанола подается в 60% концентрации. Используйте исходный раствор для приготовления растворов 15%, 25% и 40%.
- Для 15% раствора разбавьте 60 мл 60% раствора 48 мл 5 М NaCl и 48 мл PBS-MK (5x PBS с 5 мМ MgCl2 и 12,5 мМ KCl) и добавьте дистиллированную воду до 240 мл.
- Для 25% раствора развести 67 мл 60% раствора и 32 мл PBS-MK. Добавьте дистиллированную воду до 160 мл. Хорошо перемешайте и добавьте 1,6 мл раствора фенолового красного.
- Для 40% раствора разбавьте 160 мл 60% раствора 48 мл PBS-MK и добавьте дистиллированную воду до 240 мл. Для 60% раствора добавьте 1 мл фенолового красного к 100 мл 60% раствора.
- PBS 5% раствор сахарозы
- Добавьте 25 г сахарозы в флакон объемом 500 мл DPBS без кальция и магния. Хорошо встряхните и отфильтруйте с помощью вакуумного фильтра для бутылок 0,2 мкМ.
- Раствор полиэтиленгликоля (ПЭГ) 8000
- Растворите 400 г PEG 8000 и 24 г NaCl в стерильной дистиллированной воде и доведите до конечного объема 1000 мл. Перемешать при нагревании до полного растворения. Отрегулируйте pH до 7,4 с помощью бумаги.
- Фильтр стерилизуют с помощью бутылочного вакуумного фильтра 0,2 мкМ до получения 40% раствора PEG 8000. Учтите, что фильтрация займет некоторое время из-за вязкости раствора при 4 °C.
2. Культура клеток суспензии HEK293
- Для чистки используйте салфетки, смоченные в 70% этаноле. Очистите колпак биобезопасности, подготовьте и очистите все материалы, необходимые для культивирования клеток.
- Подогрейте 30 мл суспензионной среды ячейки до 37 °C в конической пробирке для культивирования объемом 50 мл. Извлечение вирусных продукционных клеток из жидкого азота. Быстро разморозьте клетки на водяной бане с температурой 37 °C. Непосредственно перед тем, как флакон полностью разморозится, очистите его салфеткой, смоченной в 70% этаноле, и перенесите флакон в колпак биобезопасности.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подробная информация о клетках, продуцирующих вирусы, приведена в таблице материалов. - Быстрый перенос клеток в предварительно подогретую коническую культуральную пробирку объемом 50 мл. Культуральные клетки в встряхивающем инкубаторе при температуре 37 °C, влажности 80%,CO2 8%, 200 оборотах в минуту (RPM) и диаметре встряхивания 50 мм. Пассажные клетки, когда жизнеспособность выше 90% и плотность клеток выше 1-3 x 106 клеток/мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используемый инкубатор имеет диаметр встряхивания 50 мм; Условия культивирования должны быть скорректированы для другого диаметра встряхивания. - Прохождение клеток через 3-4 дня после оттаивания. Проверьте культуральные пробирки, чтобы убедиться в отсутствии признаков загрязнения; Например, грибок будет проявляться в виде обесцвеченного (черного или зеленого) кольца.
- Приготовьте 400 мкл 0,4% раствора трипанового синего на образец, используя полоску объемом 1 мл.
- Быстро извлекайте суспензионные клетки из инкубатора. Немедленно извлеките 500 мкл из пробирки с помощью полоски объемом 1 мл. Аккуратно пропитывайте вверх и вниз.
- Добавьте 100 мкл клеточной суспензии в подготовленную трипановую синюю пробирку. Осторожно переверните трубку, чтобы перемешать; Не стоит пипеткой смешивать, так как это приведет к гибели клеток. Верните клетки в инкубатор.
- Возьмите 50 мкл клеточной суспензии, обработанной трипановым синим, и нанесите ее на предметное стекло гемоцитометра. Подсчитайте общее количество жизнеспособных клеток и рассчитайте количество клеточной суспензии и среды, необходимой для пассажа или трансфекции на следующий день.
- Прогрейте среду в инкубаторе на 10-15 мин. Добавьте клеточную суспензию в подогретую среду и верните в инкубатор. Для пассажных клеток в течение 3 дней (т.е. с понедельника по четверг) установите 0,5 x 106 клеток/мл; для пассажных клеток в течение 4 дней (т.е. с четверга по понедельник) установите 0,3 x 106 клеток/мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: По словам производителя, вирусные продуцирующие клетки удваиваются каждые 26 ч и должны составлять от 3,5 x 106 до 5,5 x 106 перед прохождением. Клетки можно держать до 20 проходов.
3. Трансфекция
- День 1
- За 24 ч до трансфекции культивируют 1 x 106 клеток на мл в 300 мл среды.
- День 2
- Теплая среда, плазмиды и реагент для трансфекции до комнатной температуры. Суммы, которые необходимо подготовить, приведены в таблице 1.
- Коротко вихревые плазмиды и реагенты. В подготовленную среду добавляют плазмиды, вихряют. Добавьте реагент для трансфекции и ненадолго вмешайте. Не перемешивайте смесь после этого шага. Выдерживают при комнатной температуре 30 мин.
- А пока подсчитывайте ячейки, подготовленные на 1 день. Клетки должны быть от 2 до 2,5 x 10,6 клеток на мл и > 95% жизнеспособными.
- После инкубации по каплям добавляйте смесь для трансфекции в клетки, осторожно вкручивая пробирку. Инкубируют 72-96 ч.
4. Забор клеток
- День 5
- Добавьте 33 мл 10-кратного буфера для лизиса клеток (500 мМ Tris pH 8, 10% Tween 20, 20 мМ MgCl2), перемешайте, осторожно встряхивая, и инкубируйте при 37 °C в течение 1,5 ч при встряхивании.
- Центрифуга при 3428 x g при 4 °C в течение 60 мин. Фильтруют через вакуумный фильтр PES 0,45 мкМ для осветления клеточного лизата, оставляя осветленный лизат в контейнере фильтра.
ПРИМЕЧАНИЕ: По желанию после фильтрации: возьмите 50 мкл образца для количественной ПЦР (К-ПЦР). - Добавьте 90 мл 40% раствора PEG 8000 к 360 мл отфильтрованного клеточного лизата.
- Очистите мешалку 70% этанолом и добавьте в образец. Перемешивать на льду или в холодильной камере при 300 об/мин в течение 1 ч. Инкубировать при температуре 4 °C, не перемешивая, в течение ночи.
ПРИМЕЧАНИЕ: Было проверено время инкубации от 1 ч до 72 ч. Более длительное время инкубации отрицательно сказывается на общем осаждении белка.
5. Очистка йодиксанола
- День 6
- Переложите весь объемный образец культуры с осаждением ПЭГ в чистую большую коническую пробирку и центрифугу при 2820 x g и 4°C в течение 15 минут.
- Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу ПЭГ в 15 мл DPBS с кальцием и магнием. Гранулу трудно ресуспендировать; Не пожалейте времени на то, чтобы сделать это тщательно.
- Переложите ресуспендированную часть в чистую пробирку объемом 50 мл. ПЭГ останется по бокам трубки биореактора. Добавьте еще 10 мл, стараясь собрать весь осадок ПЭГ. Перелейте все в контейнер объемом 50 мл общим объемом 25-30 мл.
- Добавьте 40 мкл ДНКазы I (10 Ед/мкл). Поместить в инкубатор на 1 ч 37°С.
ПРИМЕЧАНИЕ: По желанию после инкубации ДНКазы: возьмите 50 мкл образца для Q-ПЦР. - Стержни для перемешивания, которые использовались для осаждения ПЭГ, хорошо очистите раствором хлорида с последующим добавлением 70% этанола. Оставьте батончики в 70% этаноле для следующего эксперимента.
- Наполните полиалломерную пробирку размером 25 мм x 89 мм с помощью стеклянной пипетки Пастера 15,5 мл концентрированного клеточного лизата в каждой пробирке. После добавления клеточного лизата замените стеклянную пипетку Пастера на новую.
- Добавьте растворы йодиксанола в количестве 15%-60%: осторожно влейте 9 мл 15% раствора йодиксанола под лизат клетки. Затем добавьте 5 мл 25% и 40% растворов йодиксанола и, наконец, добавьте 5 мл 60% раствора йодиксанола.
- Долейте пробирку с помощью шприца с DPBS +/+, чтобы удалить большую часть пузырьков воздуха, стараясь не нарушить слои йодиксанола. Запечатайте трубку с помощью электрического топпера.
- Центрифуга в неповоротном роторе в течение 1 ч 10 мин при 490 000 x g при 16 °C в ультрацентрифуге. Выньте из ультрацентрифуги, соберите пробирки в металлическую застежку и подготовьте пробирки для сбора. Откройте ротор в капоте на случай разлива во время отжима.
- Подготовьте одну пробирку объемом 50 мл (для выброса пробирки ротора), одну пробирку объемом 15 мл (для сбора вируса), шприц объемом 5 мл и иглу 30 г и 19 г на градиент.
- Проколите отверстие в верхней части тюбика иглой 30G. Оставьте иглу на месте. Поместите иглу 19G в шприц.
- Осторожно проколите пробирку чуть ниже границы 40%/60%, которую можно увидеть по индикатору фенолового красного. Убедитесь, что скос иглы обращен к 40% слою.
- Извлеките иглу 30G из верхней части тюбика недоминантной рукой. Скошенной вверх иглой медленно извлеките вирус/йодиксанол. Цель состоит в том, чтобы извлечь от 3 мл до 4,5 мл. Примерно на полпути и глубоко в слой 40%/clear поверните иглу так, чтобы скос был направлен вниз, и продолжайте извлекать, чтобы избежать скопления из слоя белка.
- Подготовьте пробирку объемом 50 мл недоминирующей рукой, осторожно извлеките иглу, поместив пробирку объемом 50 мл, и выбросьте. Разбавьте суспензию AAV/йодиксанола в 5 раз в DPBS, заполнив до 15 мл.
- Переложите в центробежную фильтрующую трубку и центрифугу при 3428 x g, 4 °C в течение 10 мин. Отбраковать проточные; Осторожно снимите держатель фильтра и опрокиньте нижний контейнер в бутылку для отходов. Добавьте 15 мл PBS-5% сахарозы для фильтрации и ресуспендирования.
- Центрифуга при 3428 x g при 4 °C в течение 20 мин. Повторите замену буфера не менее 3 раз. Храните вирус (~150-250 мкл) при 4 °C (PHP. Варианты B (максимум 3 месяца) или аликвоту на аликвоты по 50 мкл и хранение при -80 °C в течение длительного времени.
ПРИМЕЧАНИЕ: PHP. Варианты капсида B чувствительны к замораживанию/оттаиванию, поэтому этого следует избегать. - Выполняйте титрование, как описано в предыдущем протоколе10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Большинство академических лабораторий используют адгезивные HEK293T клетки для производства AAV 8,9. Хотя это работает относительно хорошо, когда для прямой инъекции требуется небольшое количество AAV, для достижения аналогичной трансдукции системными капсидами, такими как AAV, необходим в 100 раз более высокий титр (минимум 1 x10 11 GC/мышь). PHP.eB.
В этом протоколе было установлено получение AAV с использованием суспензионных клеток HEK293, культивируемых в конических пробирках. Мелкомасштабные посевы можно проводить в пробирках по 50 мл, а крупные — в пробирках по 600 мл. Для специальных шейкеров (см. Таблицу материалов) можно использовать штатив, в котором можно одновременно культивировать до 16 больших пробирок. Этот штатив используется в сочетании со специальными вкладышами для пробирок объемом 50 мл (рис. 2А). Эта система обеспечивает значительный выигрыш во времени для сегмента культивирования и трансфекции этого протокола. Первоначальная настройка производства была выполнена с использованием репортерных конструкций для люциферазы и зеленого флуоресцентного белка (GFP)10,11. Параллельно конструкция GFP изготавливалась в пластинах размером 12, 15см2, как описано в ранее опубликованном протоколе12. В среднем выход 7,7 x 1012 GC был достигнут при использовании полиэтиленимина (PEI) и 2,4 x10 13 GC при использовании TransIt (рис. 2B). Для PEI это почти 3-кратное улучшение; для TransIt это в 9,2 раза лучше титров, полученных с адгезивной культурой (2,6 x 1012). При использовании для трансфекции суспензионных клеток TransIt дает примерно 3-кратное увеличение выхода по сравнению с PEI (рис. 2B).
Впоследствии производительность векторов AAV была проверена in vivo. Векторы GFP были получены с помощью PEI и TransIt и сравнены с векторами GFP, полученными с помощью классической адгезивной системы. Через 4 недели после инъекции мышей (6 недель C57BL/6 самок мышей массой 20-25 г) приносили в жертву, а экспрессию GFP в мозге мышей оценивали с помощью гистологии (рис. 3А). Сравнительный анализ проводился на сагиттальных срезах головного мозга. Не было выявлено различий в характере трансдукции вируса, полученного с помощью этих методов производства (рис. 3B). Также оценивалась люциферазная активность векторов, полученных с помощью обоих методов. Трансдукцию измеряли in vivo в течение 3 недель; картина экспрессии с течением времени одинакова независимо от того, какой реагент для трансфекции используется (рис. 4).
Далее протокол был протестирован и реализован другими членами команды (табл. 2). Производство других капсидов с PEI было успешным, что дало средний выход 3,5 x 1012 GC-векторов. Для производства капсида B10 3-кратное улучшение может быть достигнуто за счет использования TransIt по сравнению с PEI. Для другого проекта несколько конструктов, упакованных в AAv.PHP.eB, дали средний выход 3,7 х 1012, чего достаточно для внутривенного введения 7 мышей в дозе 5 х10 11 ГК на мышь. Эти результаты показывают, что протокол может быть успешно использован несколькими исследователями для различных комбинаций капсидов и конструктов.
Рисунок 1: Схематический обзор производства. На 1-й день (D1) клетки культивируют в пробирках по 300 мл. На 2-й день (D2) клетки трансфицируют соответствующими плазмидами. На 5-й день (D5) клетки собирают и лизируют с помощью 10-кратного буфера для лизиса подростков. После лизиса клеточный мусор удаляется центрифугированием. Затем клеточный лизат фильтруют для удаления крупных белков, а вирус AAV осаждают с помощью полиэтиленгликоля (ПЭГ) 8000. На 6-й день (D6) проводят очистку и концентрирование йодиксанола. Концентрат ПЭГ с предыдущего дня обрабатывают ДНКазой, а затем помещают через градиент йодиксанола. Очищенные векторы затем обессоливают и концентрируют с помощью центробежного фильтра. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Настройка инкубатора и выход AAV. (A) Клетки для продуцирования вируса культивируют во встряхивающем инкубаторе с диаметром встряхивания 50 см. Данный инкубатор оснащен переходной пластиной для пробирок объемом 600 мл и специальными вкладышами для пробирок объемом 50 мл, производимых отделением мехатроники. (B) После первоначальной настройки репортерные конструкции использовали либо полиэтиленимин (PEI; 7,7 x 1012 GC всего, n=5), либо TransIt (2,4 x 1013 GC всего, n=5) в качестве метода трансфекции и сравнивали с выходами, достигнутыми с помощью классического адгезивного метода (2,6 x 1012 GC всего, n=5), как описано в Verhaagen et al.12. Данные представлены в виде среднего ± стандартного отклонения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Паттерн экспрессии GFP после оценки in vivo . (A) Схематическое изображение типичной векторной конструкции AAV, содержащей вездесущий промотор ЦМВ немедленно-ранний энхансер, промотор β-актина курицы и акцептор сплайсинга β-глобина кролика (CAG), за которым следуют зеленый флуоресцентный белок (GFP), посттранскрипционный регуляторный элемент (WPRE) вируса гепатита Вудчака (WHV) и хвост полиаденилирования (pA)13. Здесь 6-недельным самкам мышей (n=3) была введена инъекция в хвостовую вену, содержащую 5 x 1011 общих геномных копий (gc) на мышь. Через 4 недели после инъекции мышей приносили в жертву, а мозг анализировали с помощью гистологии. (B) Репрезентативное изображение паттерна трансдукции в сагиттальных срезах с использованием адгезивных HEK293T клеток и суспензионных клеток с полиэтиленимином (PEI) или реагентом TransIt для трансфекции, аналогичная картина трансдукции наблюдается независимо от используемого метода производства. Масштабная линейка = 1000 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Одинаковая активность люциферазы независимо от метода трансфекции. (А) Схематическое изображение используемой конструкции, содержащей вездесущий промотор ЦМВ немедленно-ранний энхансер, промотор β-актина курицы и люциферазу кролика β-акцептор сплайс-глобина (CAG) люциферазу (LUC) с меткой V5 и хвост полиаденилирования бычьего гормона роста (BGHpA), 5 x10 11 GC всего/мышь (n=3) вводили через хвостовую вену, активность люциферазы в области черепа (обведена красным кружком, в примере изображения), так как биолюминесцентное изображение измерялось еженедельно. (B) Биолюминесцентная активность измерялась в виде единиц относительной люминесценции (RLU), изображенных в виде синей полосы для производства PEI и коричневой полосы для TransIt. Существенных различий в активности люциферазы в выбранной области мозга между группами не наблюдалось. Данные представлены в виде среднего ± стандартного отклонения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Таблица 1: Параметры трансфекции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.
Таблица 2: Доходность реализованного протокола. Протокол суспензии, используемый другими исследователями для получения AAV. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Системное введение ААВ является мощным инструментом для переноса генов в ЦНС; однако производство AAV является дорогостоящим и трудоемким процессом. При использовании суспензионных ячеек трудозатраты и пластмассы снижаются по сравнению с адгезивной культурой HEK293T на пластинах 15 см2 . Кроме того, конические трубы, реализованные здесь, просты в обращении и максимально эффективно используют лабораторное пространство. Протокол был разработан двумя исследователями и впоследствии применен другими исследователями в лаборатории. Серия работ, проведенных тремя независимыми исследователями, дала в среднем достаточное количество векторов на партию, чтобы ввести 6-7 мышей.
Применение суспензионных ячеек HEK293 было описано ранее13,14. Однако описанная линия суспензионных клеток не находится в свободном доступе для исследовательских целей. Это является узким местом для академических исследователей при применении описанных методов. Линия суспензионных клеток, описанная в этом протоколе, находится в свободном доступе для исследовательских целей. Культивирование суспензионных клеток проводилось в конических пробирках вместо пробирок Эрленмейера, чтобы сэкономить место и время. С помощью Erlenmeyer's можно культивировать до 4 продуктов одновременно, по сравнению с 12 продуктами с использованием конических пробирок. Конические пробирки могут быть непосредственно перенесены в центрифугу для сбора урожая.
Одной из альтернативных возможностей системы суспензионных клеточных культур является бакуловирусная система. Преимущество системы baculo заключается в том, что эти ячейки и среды находятся в открытом доступе и могут быть легко применены. Для ученых доступны репозитории, такие как Addgene, содержащие большую библиотеку готовых к использованию плазмид переноса AAV12. Несмотря на то, что они также могут иметь предостережения, такие как неисправные РМЭ, они служат хорошим источником для экспериментов plug-and-play. Выбор был сделан в пользу производственной системы на основе HEK293, поскольку имеющиеся плазмиды могут быть непосредственно использованы для производства без переноса конструкции на бакуловирус.
Для трансфекции полиэтиленин относительно дешев и, следовательно, является предпочтительным реагентом для трансфекции. В качестве альтернативы был оценен новый метод трансфекции (TransIt) для увеличения выхода векторов. Трехкратное улучшение наблюдалось при использовании вдвое меньшего количества плазмид. Это делает TransIt интересным альтернативным реагентом для трансфекции, когда требуются большие запасы. Ограничением этого является стоимость, что делает его менее интересным для небольших партий.
Таким образом, здесь представлен протокол, который может быть использован для получения высокопродуктивного AAV в суспензионных ячейках в академических лабораторных условиях. Описаны инструменты, которые могут быть использованы в академических лабораторных условиях для получения AAV с высоким выходом.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Бесплатный образец TransIT был предоставлен компанией «Мирус» для первичного тестирования, после чего реагент был приобретен для дальнейшего использования. У авторов нет других конкурирующих финансовых интересов, о которых они могли бы сообщить.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантом исследовательского фонда Королевской академии искусств и наук Нидерландов (KNAW) и грантом Start2Cure (0-TI-01). Мы благодарим Лейшу Копп за ее вклад и советы по настройке протокола. Фигуры были созданы с помощью Biorender.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 39 mL, Quick-Seal Round-Top Polypropylene Tube, 25 x 89 mm - 50Pk | Beckman Coulter | 342414 | |
| Adapter 600 mL conical tubes, for rotor S-4x1000, | eppendorf | 5920701002 | |
| Adapter Plate fits 16 bioreactors of 600 ml | Infors HT/ TPP | 587633 | |
| Aerosol-tight caps, for 750 mL round buckets | eppendorf | 5820747005 | |
| Centrifuge 5920 R G, 230 V, 50-60 Hz, incl. rotor S-4x1000, round buckets and adapter 15 mL/50 mL conical tubes | eppendorf | 5948000315 | |
| Distilled Water | Gibco | 15230147 | |
| DNase I recombinant, RNase-free | Roche | 4716728001 | |
| DNase I recombinant, RNase-free | Roche | 4716728001 | |
| DPBS, calcium, magnesium | Gibco | 14040091 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190144 | |
| Fisherbrand Disposable PES Filter Units 0,2 | Fisher | FB12566504 | |
| Fisherbrand Disposable PES Filter Units 0,45 | Fisher | FB12566505 | |
| Holder for 50 ml culture tubes also fits falcon tube | Infors HT/ TPP | 31362 | |
| Holder for 600 ml cell culture tube | Infors HT/ TPP | 66129 | |
| Incubator Minitron 50 mm | Infors HT | 500043 | |
| LV-MAX Production Medium | Gibco | A3583401 | |
| N-Tray Universal | Infors HT/ TPP | 31321 | |
| OptiPrep - Iodixanol | Serumwerk bernburg | 1893 | |
| PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000) | Poly-sciences | 24765-100 | |
| Phenol red solution | Sigma-Aldrich | 72420100 | |
| Poly(ethylene glycol) 8000 | Sigma-Aldrich | 89510 | |
| TransIT-VirusGEN | Mirus | Mir 6706 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 5250061 | |
| TubeSpin Bioreactors-50ml | TTP | 87050 | |
| TubeSpin Bioreactors-600ml | TTP | 87600 | |
| Viral Production Cells | Gibco | A35347 | |
| Vivaspin 20 MWCO 100 000 | Cytvia | 28932363 |
References
- Zhou, K., Han, J., Wang, Y., Zhang, Y., Zhu, C. Routes of administration for adeno-associated viruses carrying gene therapies for brain diseases. Front Mol Neurosci. 15, 988914 (2022).
- Pietersz, K. L., et al. PhP.B Enhanced adeno-associated virus mediated-expression following systemic delivery or direct brain administration. Front Bioeng Biotechnol. 9, 679483 (2021).
- Zhang, H., et al. Several rAAV vectors efficiently cross the blood–brain barrier and transduce neurons and astrocytes in the neonatal mouse central nervous system. MolTher. 19 (8), 1440-1448 (2011).
- Deverman, B. E., et al. Cre-dependent selection yields AAV variants for widespread gene transfer to the adult brain. Nat Biotechnol. 34 (2), 204-209 (2016).
- Chan, K. Y., et al. Engineered AAVs for efficient noninvasive gene delivery to the central and peripheral nervous systems. Nat Neurosci. 20, 1172-1179 (2017).
- Goertsen, D., et al. AAV capsid variants with brain-wide transgene expression and decreased liver targeting after intravenous delivery in mouse and marmoset. Nat. Neurosci. 25 (1), 106-115 (2022).
- Foust, K. D., et al. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nat Biotechnol. 27 (1), 59-65 (2008).
- Challis, R. C., et al. Systemic AAV vectors for widespread and targeted gene delivery in rodents. Nat Protoc. 14 (2), 379-414 (2019).
- Fripont, S., Marneffe, C., Marino, M., Rincon, M. Y., Production Holt, M. G. purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors. J Vis Exp. (143), e58960 (2019).
- Fagoe, N. D., Eggers, R., Verhaagen, J., Mason, M. R. J. A compact dual promoter adeno-associated viral vector for efficient delivery of two genes to dorsal root ganglion neurons. Gene Thr. 21 (3), 242-252 (2014).
- Verhaagen, J., et al. Retinal gene therapy, methods and protocols. Meth Mol Biol. 1715, 3-17 (2018).
- Nasse, J. S., et al. Addgene AAV data hub: A platform for sharing AAV experimental data. Nat Meth. 20 (9), 1271-1272 (2023).
- Grieger, J. C., Soltys, S. M., Samulski, R. J. Production of recombinant adeno-associated virus vectors using suspension HEK293 cells and continuous harvest of vector from the culture media for GMP FIX and FLT1 clinical vector. Mol Ther. 24 (2), 287-297 (2016).
- Blessing, D., Déglon, N., Schneider, B. L. Recombinant protein expression in mammalian cells, methods and protocols. Meth Mol Biol. 1850, 259-274 (2018).
