Isolamento T de linfócitos humanos, Cultura e Análise da Migração In Vitro</em
Summary
Migração de linfócitos T ocorre durante homing para órgãos linfóides, saia do vasculatura, e entrando em tecidos periféricos. Aqui, nós descrevemos um protocolo que pode ser usado para analisar migração de linfócitos T<em> In vitro</em>.
Abstract
A migração de linfócitos T envolve a interação adesivo de integrinas da superfície celular com ligantes expressos em outras células ou com proteínas da matriz extracelular. A ativação das integrinas preciso espaço-temporal de um estado de baixa afinidade para um estado de alta afinidade no limite da célula líder é importante para a migração de linfócitos T<sup> 1</sup>. Da mesma forma, a retração da borda das células à direita, ou uropod, é um passo necessário na manutenção persistente integrina-dependente motilidade linfócitos T<sup> 2</sup>. Muitas abordagens terapêuticas para auto-imunes ou inflamatórias integrinas doenças-alvo, como forma de inibir o recrutamento excessivo e migração dos leucócitos<sup> 3</sup>. Para estudar os eventos moleculares que regulam a migração de linfócitos T humanos, nós utilizamos um<em> In vitro</em> Sistema para analisar a migração de células em um substrato bidimensional que imita o ambiente que um linfócito T encontra durante o recrutamento da vasculatura. Linfócitos T são os primeiros isolados de doadores humanos e são, então, estimulado e cultivado por sete a dez dias. Durante o ensaio, os linfócitos T estão autorizados a aderir e migrar sobre um substrato revestido com uma molécula de adesão intercelular (ICAM-1), um ligante de integrina LFA-1, eo fator-1 de células derivadas do estroma (SDF-1). Nossos dados mostram que os linfócitos T apresentam uma velocidade de migração de ~ 15 mm / min. Migração de linfócitos T podem ser inibidos pelo bloqueio integrina<sup> 1</sup> Ou por inibidores da máquina actomyosin celular que regula a migração celular<sup> 2</sup>.
Protocol
Discussion
Neste experimento, nós fornecemos detalhes sobre um sistema simples para analisar a motilidade do principal linfócitos T humanos. Ensaios de migração in vitro têm sido usadas para dissecar os papéis de muitas moléculas e vias de sinalização envolvidas na locomoção de vários tipos de células. Alguns controles fundamentais para manter em mente ao projetar sua própria experiência de nosso protocolo incluem: 1) não-adesiva ou não-integrina revestimentos adesivos, substratos tais como album…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este projecto foi apoiado pelo National Institutes of Health Grants HL087088 (MK) e HL18208 (MK).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| RPMI 1640 | Gibco | 11875 | ||
| FBS | Thermo Scientific | SH300070.03 | ||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140 | ||
| 1-Step Polymorphs | Accurate Chemical | AN221725 | ||
| PHA | Remel/Fisher Scientific | R30852801 | ||
| Rec. human IL-2 | R&D Systems | 202-IL | ||
| Rec. human IL-15 | R&D Systems | 247-IL | ||
| Protein G | Sigma Aldrich | 19459 | ||
| Rec. human ICAM-1/Fc | R&D Systems | 720-IC | ||
| Rec. human SDF-1 | R&D Systems | 350-NS |
References
- Hyun, Y. M., Chung, H. L., McGrath, J. L., Waugh, R. E., Kim, M. Activated integrin VLA-4 localizes to the lamellipodia and mediates t cell migration on VCAM-1. J Immunol. 183, 359-369 (2009).
- Morin, N. A., Oakes, P. W., Hyun, Y. M., Lee, D., Chin, Y. E., King, M. R., Springer, T. A., Shimaoka, M., Tang, J. X., Reichner, J. S., Kim, M. Nonmuscle myosin heavy chain IIA mediates integrin LFA-1 de-adhesion during T lymphocyte migration. The Journal of experimental medicine. 205, 195-205 (2008).
- Hyun, Y. M., Lefort, C. T., Kim, M. Leukocyte integrins and their ligand interactions. Immunologic research. , (2009).
