استخراج الحمض النووي من مقطع الذيل: طريقة تستخدم في جينوتيبينج حمار وحشي

Overview

توضح هذه المقالة استخراج الحمض النووي من مقطع ذيل حمار وحشي. يوضح البروتوكول طريقة سريعة وفعالة لتحليل الأنماط الجينية لسمك الحمار الوحشي.

Protocol

1. إعداد الحمض النووي

1. إعداد الحمض النووي تحلل العازلة: 50 MM KCl، 10 mM تريس-HCl pH 8.3، 0.3٪ توين 20، 0.3٪ NP40. أضف بروتيناز K الطازج إلى تركيز نهائي قدره 1 ملغم /مل في يوم الاستخدام.
2. جمع الأنسجة:
   1. لمقطع زعانف السمك الكبار:
      1. تخدير الأسماك: ضع السمك في حل MS-222 (tricaine) بنسبة 0.004٪. انتظر حتى تبطئ حركة الخيشوم.
      2. وضع السمك على كومة من 5-10 Kimwipes وقطع قطعة صغيرة من زعنفة الذيل، حوالي 2-3 ملم، مع شفرة حلاقة معقمة.
      3. بسرعة وضع الأسماك في خزان المسمى مع المياه العذبة للتعافي؛ تسمية بعناية كل من الخزان وأنبوب المقابلة التي سوف تحتوي على مقطع زعنفة. تغيير المياه وإطعام الأسماك كل يومين.
      4. التقاط مقطع زعنفة مع طرف ماصة معقمة ونقله إلى أنبوب مليئة 100 ميكرولتر الحمض النووي تحلل العازلة.
      5. تجاهل طرف ماصة، وتجاهل شفرة الحلاقة في حاوية حادة.
   2. لمقطع ذيل الجنين:
      1. ضع الأجنة في محلول MS-222 (tricaine) بنسبة 0.004٪. انتظر دقيقتين.
      2. قطع قطعة من الذيل مع ملقط تحت المجهر تشريح.
      3. وضع الذيل في أنبوب المسمى مليئة 30 ميكرولتر الحمض النووي تحلل العازلة.
      4. وضع الجنين بسرعة في أنبوب يحتوي على 100 ميكرولتر 4٪ بارافورمالديهايد.
      5. تسمية أنابيب مع الأجنة وأنابيب الذيل المقابلة لها.
      6. تخزين الأنابيب مع الأجنة في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها لتثبيت.
      7. تنظيف ملقط باستخدام المياه ميلي كيو و Kimwipes بين كل جنين للحد من التلوث.
   3. للأجنة الكاملة:
      1. ضع الأجنة في محلول MS-222 (tricaine) بنسبة 0.004٪. انتظر دقيقتين.
      2. وضع 1-5 الأجنة في أنبوب مليئة 100 ميكرولتر الحمض النووي تحلل العازلة. إزالة الكورسيون ليست ضرورية.
3. هضم الحمض النووي
   احتضان الأنابيب مع الأنسجة (زعنفة أو مقاطع الذيل أو الأجنة) في 55 درجة مئوية لمدة 4 ساعات حتى بين عشية وضحاها.
4. تعطيل بروتيناز K
   يجب استخدام أنابيب الحرارة إلى 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة من الحمض النووي ل PCR على الفور ، أو تخزينها عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 Reaction LightScanner Master Mix	BioFire	HRLS-ASY-0002	www.biofiredx.com
Tricaine
Paraformaldehyde