Lagdelt agarmontering: Forbereder levende sebrafiskembryoer for langtidsavbildning med et invertert mikroskop

Abstract

Kilde: Upadhyay S., et.al. En lagdelt monteringsmetode for utvidet konfokal mikroskopi av hele sebrafiskembryoer. J. Vis. Utt. (2020).

Denne artikkelen beskriver en metode for å montere levende sebrafiskembryoer for langsiktig avbildning. Denne metoden er kostnadseffektiv og enkel å utføre ved hjelp av vanlige mikroskopiretter med glassbunn for avbildning på invertert mikroskop. Monteringen utføres i lag av agarose ved forskjellige konsentrasjoner.

Protocol

1. Fremstilling av embryoer Etter parring, høst embryoer i E3 i en Petri-tallerken og inkuber dem ved 26,5 °C i ca. 28 timer før montering.MERK: Dette bremser utviklingen av embryoene slik at embryoene er omtrent på 30 somittstadium i begynnelsen av avbildningen. Bedøv embryoer i 0,016-0,020% trikain i E3. For å hemme pigmentering, legg PTU til en konsentrasjon på 200 μM. Dechorionate embryoene ved hjelp av tang under et dissekerende mikroskop. …

Representative Results

Figur 1 : Beskrivelse av monteringsmetode. (A) Tilsett sebrafiskembryoet i den lille brønnen som er laget av glassbunnen i 35 mm parabolen. (B) Tilsett agaroselag 1 i den lille brønnen for å dekke embryoet. (C) Legg forsiktig et dekselglass over den lille brønnen. (D) Tilsett agaroselag 2 på hele bunnen av 35 mm parabolen. (E) Tilsett E3 i retten. (F) Skjematisk tegning av et tverrsnitt av monteringsoppsettet. (G) Mi…

Materials

Low melting agarose	Sigma-Aldrich, MO	A9414	Store dissolved solution at 4 °C
35 mm glass bottom dishes with No. 0 coverslip and 10 mm diameter of glass bottom	MatTek Corporation, MA	P35GCOL-0-10-C
Tricaine (MS-222)	Sigma-Aldrich, MO	E10521	Store dissolved solution at 4 °C
N-phenylthiourea (PTU)	Sigma-Aldrich, MO	P7629	Store dissolved solution at -20 °C
DMC4500 digital microscope camera	Leica	NA
Micro cover glass 22×22 mm	VWR	48366 067