DNA-Stabiele Isotopen sondering (DNA-SIP)
Summary
DNA-stabiele isotoop sonderen is een teelt-onafhankelijke methode voor het identificeren en karakteriseren van actieve gemeenschappen van micro-organismen die in staat zijn gebruik te maken van specifieke substraten. Assimilatie van de ondergrond verrijkt met zware isotoop leidt tot opname van gelabelde atomen in de microbiële biomassa. Dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie haalt gelabeld DNA voor de downstream-moleculaire analyses.
Abstract
DNA-stabiele isotoop indringende (DNA-SIP) is een krachtige techniek voor het identificeren van actieve micro-organismen die bepaalde koolstofsubstraten en voedingsstoffen te assimileren in cellulaire biomassa. Als zodanig is deze teelt-onafhankelijke-techniek is een belangrijke methode voor het toewijzen van metabolische functie om de diverse gemeenschappen bewoont een breed scala van terrestrische en aquatische milieus. Na de incubatie van een milieu-monster met een stabiele isotoop-gelabelde stoffen, wordt gewonnen nucleïnezuur onderworpen aan dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie en de daaropvolgende helling fractionering aan nucleïnezuren van verschillende dichtheden scheiden. Zuivering van DNA van cesium chloride ophaalt gelabeld en ongelabelde DNA voor verdere moleculaire karakterisering (bijvoorbeeld vingerafdrukken, microarrays, kloon bibliotheken, metagenomica). Deze video Jove protocol biedt visuele stap-voor-stap uitleg van het protocol voor de dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie, gradiënt fractionering en herstel van gelabelde DNA. Het protocol bevat ook proeven van SIP-gegevens en belicht belangrijke tips en waarschuwingen die moeten worden beschouwd als een succesvolle DNA-SIP-analyse te garanderen.
Protocol
Discussion
Goed ontwerp van stabiele isotoop-probing experimenten is van cruciaal belang voor het verkrijgen van het label DNA boven de achtergrond ongelabelde gemeenschap. Overwegingen met betrekking tot incubatietijden, substraatconcentraties, incubatieomstandigheden (bv. voedingsstoffen, bodemvocht), cross-voeding en replicatie monster zijn elders 10,18 besproken en adviseren wij de lezer deze publicaties bij het ontwerpen van een SIP-incubatie. Gerelateerd aan de huidige protocol, is het de moeite waard commen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door Strategic Project en Discovery Subsidies voor JDN van het Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Bromophenol Blue | Reagent | Fisher Scientific | BP115-25 | |
| Cesium chloride | Reagent | Fisher Scientific | BP210-500 | |
| Ethanol, reagent grade | Reagent | Sigma-Aldrich | 652261 | |
| Ethidium bromide | Reagent | Sigma-Aldrich | E1510 | |
| Hydrochloric acid | Reagent | Fisher Scientific | 351285212 | |
| Linear polyacrylamide | Reagent | Applichem | A6587 | |
| Polyethylene Glycol 6000 | Reagent | VWR | CAPX1286L-4 | |
| Potassium Chloride | Reagent | Fisher Scientific | AC42409-0010 | |
| Sodium Chloride | Reagent | Fisher Scientific | S2711 | |
| Sodium Hydroxide pellets | Reagent | Fisher Scientific | S3181 | |
| Tris base | Reagent | Fisher Scientific | BP1521 | |
| Dark Reader | Equipment | Clare Chemical | DR46B | |
| Microcentrifuge | Equipment | Eppendorf | 5424 000.410 | |
| Nanodrop 2000 | Equipment | Fisher Scientific | 361013650 | |
| Infusion pump | Equipment | Braintree Scientific | N/A | Model Number: BSP See www.braintreesci.com for ordering details. |
| Tube sealer | Equipment | Beckman-Coulter | 358312 | |
| Ultracentrifuge | Equipment | Beckman-Coulter | ||
| Ultracentrifuge rotor | Equipment | Beckman-Coulter | 362754 | |
| Ultraviolet light source | Equipment | UVP Inc. | 95-0017-09 | Any UV source will suffice |
| Ultraviolet light face shield | Equipment | Fisher Scientific | 114051C | |
| Butyl rubber stoppers, gray | Material | Sigma-Aldrich | 27232 | |
| Centrifuge tubes | Material | Beckman-Coulter | 342412 | |
| Hypodermic needle, 23 gauge, 2” length | Material | BD | 305145 | |
| Microfuge tubes, 1.5 mL | Material | DiaMed | AD151-N500 | |
| Open center seals, 20 mm diameter | Material | Sigma-Aldrich | 27230-U | |
| Pasteur pipettes, glass | Material | Fisher Scientific | 13-678-6C | |
| Pipet tips | Material | DiaMed | BPS340-1000 | Catalogue number is for 200 μl tips. 10 or 20 μl tips may be purchased from the same source |
| Pump tubing 1.5 mm bore x 1.5 mm wall | Material | Appleton Woods | ||
| Screw-cap tubes, 15 mL | Material | DiaMed | AD15MLP-S | |
| Serum vials, 125 mL volume | Material | Sigma-Aldrich | Z114014 | |
| Syringe, 60 mL | Material | BD | 309653 |
References
- Neufeld, J. D. DNA stable-isotope probing. Nat. Protocols. 2, 860-866 (2007).
- Neufeld, J. D., Boden, R., Moussard, H., Schäfer, H., Murrell, J. C. Substrate-specific clades of active marine methylotrophs associated with a phytoplankton bloom in a temperate coastal environment. Appl. Environ. Microbiol. 74, 7321-7328 (2009).
- Nercessian, O., Noyes, E., Kalyuzhnaya, M. G., Lidstrom, M. E., Chistoserdova, L. Bacterial populations active in metabolism of C1 compounds in the sediment of Lake Washington, a freshwater lake. Appl. Environ. Microbiol. 71, 6885-6899 (2005).
- Padmanabhan, P. Respiration of 13C-labelled substrates added to soil in the field and subsequent 16S rRNA gene analysis of 13C-labelled soil DNA. Appl. Environ. Microbiol. 69, 1614-1622 (2003).
- Bernard, L. Dynamics and identification of soil microbial populations actively assimilating carbon from 13C-labelled wheat residue as estimated by DNA- and RNA-SIP techniques. Environ. Microbiol. 9, 752-764 (2007).
- Haichar, e. l. Z. a. h. a. r., F, . Identification of cellulolytic bacteria in soil by stable isotope probing. Environ. Microbiol. 9, 625-634 (2007).
- Addison, S., McDonald, I., Lloyd-Jones, G. Stable isotope probing: Technical considerations when resolving 15N-labelled RNA in gradients. J. Microbiol. Meth. 80, 70-75 (2009).
- Buckley, D. H., Huangyutitham, V., Hsu, S. -. F., Nelson, T. A. Stable isotope probing with 15N achieved by disentangling the effects of genome G + C content and isotope enrichment on DNA density. Appl. Environ. Microbiol. 73, 3189-3195 (2007).
- Schwartz, E. Characterization of growing microorganisms in soil by stable isotope probing with H218O. Appl. Environ. Microbiol. 73, 2541-2546 (2007).
- Neufeld, J. D., Dumont, M. G., Vohra, J., Murrell, J. C. Methodological considerations for the use of stable isotope probing in microbial ecology. Microb. Ecol. 53, 435-442 (2007).
- Martineau, C., Whyte, L., Greer, C. Development of a SYBR safe technique for the sensitive detection of DNA in cesium chloride density gradients for stable isotope probing assays. J. Microbiol. Meth. 73, 199-202 (2008).
- Bartram, A. K., Poon, C., Neufeld, J. D. Nucleic acid contamination of glycogen used in nucleic acid precipitation and assessment of linear polyacrylamide as an alternative co-precipitant. Biotechniques. 47, 1019-1022 (2009).
- Chen, Y. Revealing the uncultivated majority: combining DNA stable-isotope probing, multiple displacement amplification and metagenomic analyses of uncultivated Methylocystis in acidic peatlands. Environ. Microbiol. 10, 2609-2622 (2008).
- Neufeld, J. D., Chen, Y., Dumont, M. G., Murrell, J. C. Marine methylotrophs revealed by stable-isotope probing, multiple displacement amplification and metagenomics. Environ. Microbiol. 10, 1526-1535 (2008).
- Kalyuzhnaya, M. High-resolution metagenomics targets specific functional types in complex microbial communities. Nat. Biotechnol. 26, 1029-1034 (2008).
- Binga, E. K., Lasken, R. S., Neufeld, J. D. Something from (almost) nothing: the impact of multiple displacement amplification on microbial ecology. ISME J. 2, 233-241 (2008).
- Green, S. J., Leigh, M. B., Neufeld, J. D., Timmis, K. N. . Microbiology of Hydrocarbon and Lipid Microbiology. , 4137-4158 (2010).
- Neufeld, J. D., Wagner, M., Murrell, J. C. Who eats what, where and when? Isotope-labelling experiments are coming of age. ISME J. 1, 103-110 (2007).
- Gallagher, E., McGuinness, L., Phelps, C., Young, L. Y., Kerkhof, L. J. DNA shortens the incubation time needed to detect benzoate-utilizing denitrifying bacteria by stable-isotope probing. Appl. Environ. Microbiol. 71, 5192-5196 .
