डीएनए स्थिर आइसोटोप जांच (डीएनए एसआईपी)
Summary
आइसोटोप – स्थिर डीएनए जांच की खेती स्वतंत्र पहचान और सूक्ष्मजीवों कि विशिष्ट substrates का उपयोग करने में सक्षम हैं के सक्रिय समुदायों विशेषताएँ विधि है. भारी आइसोटोप में समृद्ध सब्सट्रेट के आत्मसात माइक्रोबियल बायोमास में लेबल परमाणुओं का समावेश करने के लिए होता है. घनत्व ढाल ultracentrifugation बहाव आणविक विश्लेषण के लिए लेबल डीएनए retrieves.
Abstract
स्थिर आइसोटोप डीएनए जांच (डीएनए घूंट) सक्रिय सूक्ष्मजीवों कि सेलुलर बायोमास में विशेष रूप से कार्बन substrates और पोषक तत्वों को आत्मसात की पहचान के लिए एक शक्तिशाली तकनीक है. जैसे, इस तकनीक की खेती स्वतंत्र स्थलीय और जलीय वातावरण की एक विस्तृत श्रृंखला inhabiting विविध समुदायों के लिए चयापचय समारोह असाइन करने के लिए एक महत्वपूर्ण पद्धति किया गया है. स्थिर आइसोटोप लेबल यौगिकों के साथ एक पर्यावरण नमूने के ऊष्मायन के बाद, निकाले न्यूक्लिक एसिड घनत्व ढाल ultracentrifugation और बाद में ढाल fractionation के अधीन है भिन्न घनत्व की nucleic एसिड अलग. सीज़ियम क्लोराइड से डीएनए के शोधन लेबल और retrieves unlabelled बाद आणविक लक्षण वर्णन (जैसे फिंगरप्रिंटिंग, प्रोटीन, क्लोन पुस्तकालयों metagenomics,) के लिए डीएनए. यह जौव वीडियो प्रोटोकॉल घनत्व ultracentrifugation ढाल, ढाल fractionation और लेबल डीएनए की वसूली के लिए प्रोटोकॉल का दृश्य कदम दर कदम स्पष्टीकरण प्रदान करता है. प्रोटोकॉल भी नमूना घूंट डेटा और महत्वपूर्ण सुझावों पर प्रकाश डाला गया शामिल हैं और चेतावनी देते हैं कि एक सफल विश्लेषण डीएनए घूंट सुनिश्चित करने के लिए विचार किया जाना चाहिए.
Protocol
Discussion
स्थिर आइसोटोप जांच प्रयोगों के उचित डिजाइन पृष्ठभूमि unlabelled समुदाय के ऊपर लेबल डीएनए प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण महत्व का है. ऊष्मायन बार, सब्सट्रेट सांद्रता, ऊष्मायन स्थितियों (जैसे पोषक तत्वों, मि?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम सामरिक परियोजना और प्राकृतिक विज्ञान और कनाडा के इंजीनियरिंग रिसर्च काउंसिल () NSERC से डिस्कवरी JDN को अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Bromophenol Blue | Reagent | Fisher Scientific | BP115-25 | |
| Cesium chloride | Reagent | Fisher Scientific | BP210-500 | |
| Ethanol, reagent grade | Reagent | Sigma-Aldrich | 652261 | |
| Ethidium bromide | Reagent | Sigma-Aldrich | E1510 | |
| Hydrochloric acid | Reagent | Fisher Scientific | 351285212 | |
| Linear polyacrylamide | Reagent | Applichem | A6587 | |
| Polyethylene Glycol 6000 | Reagent | VWR | CAPX1286L-4 | |
| Potassium Chloride | Reagent | Fisher Scientific | AC42409-0010 | |
| Sodium Chloride | Reagent | Fisher Scientific | S2711 | |
| Sodium Hydroxide pellets | Reagent | Fisher Scientific | S3181 | |
| Tris base | Reagent | Fisher Scientific | BP1521 | |
| Dark Reader | Equipment | Clare Chemical | DR46B | |
| Microcentrifuge | Equipment | Eppendorf | 5424 000.410 | |
| Nanodrop 2000 | Equipment | Fisher Scientific | 361013650 | |
| Infusion pump | Equipment | Braintree Scientific | N/A | Model Number: BSP See www.braintreesci.com for ordering details. |
| Tube sealer | Equipment | Beckman-Coulter | 358312 | |
| Ultracentrifuge | Equipment | Beckman-Coulter | ||
| Ultracentrifuge rotor | Equipment | Beckman-Coulter | 362754 | |
| Ultraviolet light source | Equipment | UVP Inc. | 95-0017-09 | Any UV source will suffice |
| Ultraviolet light face shield | Equipment | Fisher Scientific | 114051C | |
| Butyl rubber stoppers, gray | Material | Sigma-Aldrich | 27232 | |
| Centrifuge tubes | Material | Beckman-Coulter | 342412 | |
| Hypodermic needle, 23 gauge, 2” length | Material | BD | 305145 | |
| Microfuge tubes, 1.5 mL | Material | DiaMed | AD151-N500 | |
| Open center seals, 20 mm diameter | Material | Sigma-Aldrich | 27230-U | |
| Pasteur pipettes, glass | Material | Fisher Scientific | 13-678-6C | |
| Pipet tips | Material | DiaMed | BPS340-1000 | Catalogue number is for 200 μl tips. 10 or 20 μl tips may be purchased from the same source |
| Pump tubing 1.5 mm bore x 1.5 mm wall | Material | Appleton Woods | ||
| Screw-cap tubes, 15 mL | Material | DiaMed | AD15MLP-S | |
| Serum vials, 125 mL volume | Material | Sigma-Aldrich | Z114014 | |
| Syringe, 60 mL | Material | BD | 309653 |
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