DNA kararlı izotop problama özel substratlar kullanma yeteneğine sahip olan mikroorganizmaların aktif toplulukları tanımlamak ve karakterize etmek için bir kültür bağımsız bir yöntemdir. Ağır izotop zenginleştirilmiş substrat Asimilasyon etiketli atomların mikrobiyal biyokütle içine dahil yol açar. Yoğunluk degrade Ultrasantrifügasyon downstream moleküler analizler için işaretli DNA alır.
DNA stabil izotop (DNA-SIP) problama özellikle hücresel biyokütle içinde karbon yüzeyleri ve besin asimile aktif mikroorganizmaların belirlenmesi için güçlü bir tekniktir. Bunun gibi, bu, yetiştirme bağımsız tekniği, geniş bir yelpazede karasal ve sucul ortamlarda yaşayan farklı toplulukların metabolik fonksiyonu atama için önemli bir yöntem olmuştur. Istikrarlı izotop etiketli bileşikler ile çevresel bir örnek inkübasyon ardından, çıkarılan nükleik asit, nükleik asitlerin farklı yoğunlukları ayrı bir yoğunluk gradiyenti Ultrasantrifügasyon ve sonraki degrade fraksiyonasyon tabi tutulur. Sezyum klorür DNA saflaştırılması sonraki moleküler karakterizasyonu (örneğin parmak izi, mikroarrayler, klon kütüphaneler, metagenomics) DNA etiketli ve etiketlenmemiş alır. Bu vallahi video protokol yoğunluk gradiyenti Ultrasantrifügasyon, degrade fraksiyonasyon ve işaretli DNA kurtarma için protokol görsel olarak adım adım açıklamalar sağlar. Protokol, aynı zamanda örnek SIP veri ve golleri önemli ipuçları içerir ve başarılı bir SIP DNA analizi sağlamak için düşünülmesi gerektiğini uyarıyor.
Kararlı izotop sondalama deneyleri doğru tasarım arka plan etiketlenmemiş topluluk yukarıdaki işaretli DNA elde etmek için kritik önem taşımaktadır. Inkübasyon sürelerinde, substrat konsantrasyonları, inkübasyon koşulları (örneğin, besin, toprak nem içeriği), çapraz besleme ve çoğaltma örnek ilgili Hususlar başka 10,18 tartışılan ve bir SIP inkübasyon tasarlarken okuyucu bu yayınların başvurun tavsiye edilmiştir. Geçerli protokol, SIP gradyanlar verilerin yorumlanması ile i…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma Stratejik Proje ve Kanada Doğal Bilimler ve Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC) JDN Discovery Hibeler tarafından desteklenmiştir.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Bromophenol Blue | Reagent | Fisher Scientific | BP115-25 | |
Cesium chloride | Reagent | Fisher Scientific | BP210-500 | |
Ethanol, reagent grade | Reagent | Sigma-Aldrich | 652261 | |
Ethidium bromide | Reagent | Sigma-Aldrich | E1510 | |
Hydrochloric acid | Reagent | Fisher Scientific | 351285212 | |
Linear polyacrylamide | Reagent | Applichem | A6587 | |
Polyethylene Glycol 6000 | Reagent | VWR | CAPX1286L-4 | |
Potassium Chloride | Reagent | Fisher Scientific | AC42409-0010 | |
Sodium Chloride | Reagent | Fisher Scientific | S2711 | |
Sodium Hydroxide pellets | Reagent | Fisher Scientific | S3181 | |
Tris base | Reagent | Fisher Scientific | BP1521 | |
Dark Reader | Equipment | Clare Chemical | DR46B | |
Microcentrifuge | Equipment | Eppendorf | 5424 000.410 | |
Nanodrop 2000 | Equipment | Fisher Scientific | 361013650 | |
Infusion pump | Equipment | Braintree Scientific | N/A | Model Number: BSP See www.braintreesci.com for ordering details. |
Tube sealer | Equipment | Beckman-Coulter | 358312 | |
Ultracentrifuge | Equipment | Beckman-Coulter | ||
Ultracentrifuge rotor | Equipment | Beckman-Coulter | 362754 | |
Ultraviolet light source | Equipment | UVP Inc. | 95-0017-09 | Any UV source will suffice |
Ultraviolet light face shield | Equipment | Fisher Scientific | 114051C | |
Butyl rubber stoppers, gray | Material | Sigma-Aldrich | 27232 | |
Centrifuge tubes | Material | Beckman-Coulter | 342412 | |
Hypodermic needle, 23 gauge, 2” length | Material | BD | 305145 | |
Microfuge tubes, 1.5 mL | Material | DiaMed | AD151-N500 | |
Open center seals, 20 mm diameter | Material | Sigma-Aldrich | 27230-U | |
Pasteur pipettes, glass | Material | Fisher Scientific | 13-678-6C | |
Pipet tips | Material | DiaMed | BPS340-1000 | Catalogue number is for 200 μl tips. 10 or 20 μl tips may be purchased from the same source |
Pump tubing 1.5 mm bore x 1.5 mm wall | Material | Appleton Woods | ||
Screw-cap tubes, 15 mL | Material | DiaMed | AD15MLP-S | |
Serum vials, 125 mL volume | Material | Sigma-Aldrich | Z114014 | |
Syringe, 60 mL | Material | BD | 309653 |