레트로바이러스 매개 형질도입: 암세포에 표적 유전자를 도입하는 방법

초록

출처: Kesarwani, M., et al. 종양유전자 의존성에서 c-fos 및 dusp1의 역할을 평가하는 방법. J. Vis. 특급 (2019).

이 동영상은 만성 골수성 백혈병 세포주에서 레트로바이러스를 사용하여 표적 유전자를 전달하여 유전자 검증을 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 레트로바이러스는 형질도입(transduction)이라는 과정을 통해 유전 물질을 백혈병 세포로 전달하는 매개체 역할을 하며, 이를 통해 표적 유전자의 장기 발현을 가능하게 합니다. 이 방법은 유전자 검증 및 치료제 개발을 위해 모든 표적 세포에 적용할 수 있습니다.

프로토콜

1. 변환

1. 레트로바이러스 플라스미드 형질주입(Retroviral plasmid transfection)
   1. HEK293 세포를 37°C로 설정된 수조에서 전날 오후에 갓 해동합니다. HEK 세포가 들어 있는 냉동 튜브를 실온에서 435 x g으로 3분 동안 돌립니다. 진공 청소기를 통해 상층액을 제거하고 10% FBS, 페니실린, 스트렙토마이신 및 글루타민이 보충된 1mL의 DMEM에 세포 펠렛을 현탁합니다.
   2. 세포를 세고 10cm 처리된 접시(~4 x 10,⁶ HEK293T 세포)에 적절한 부피를 추가합니다. DMEM 10 배지 14mL를 접시에 넣고 위아래로 밀어 균일하게 분포되도록 잘 혼합합니다. 접시를 37 ° C, 5 % CO₂ 인큐베이터에 밤새 놓습니다.
   3. 다음 날 아침, 도립 광 현미경으로 세포의 합류 지점을 확인합니다(50% 이상이 잘 작동함).
   4. 마이크로피펫을 사용하여 1.5 mL 튜브(= 500 μL)에 DNA(원하는 레트로바이러스 플라스미드), PclEco(패키징 플라스미드), 2 M CaCl₂ 및 H₂0을 7.....

결과

그림 1: 이식된 마우스와 WT 마우스의 혈액에서 YFP+ 세포의 빈도를 보여주는 FACS(음성 대조군). 위쪽 패널에는 셀과 게이팅의 산점도가 표시됩니다. 아래쪽 패널은 YFP 대 측면 산란의 히스토그램을 보여줍니다. MFI가 >10³인 세포는 YFP+로 간주되었습니다. 형질도입 비율을 계산하기 위해 형질도입 후 골수 세포에 대해서도 유사한 게이팅이 사용되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
DMEM을 참조하십시오.	셀그로(corning)	15-013-CV
RetroNectin 재조합 인간 피브로넥틴 단편	다카라	T100B
FBS(증권 시세	애틀랜타 생물학	S11150
펜/스트렙	셀그로(corning)	30-002-CI
L-글루타민	셀그로(corning)	제25-005-CL	물에 5mg/mL 스톡
헤페스	시그마	H7006
PBS (PBS)	코 닝	21040CV
나2HPO4.7H2O	시그마	S9390
염화칼슘	인비트로젠	K278001
HBS 2개	인비트로젠	K278002
에디타	앰비언	AM9261
증권 시세	시그마	A7906
Human Long-Term Culture Initiating Cell Assay(인간 장기 배양 시작 세포 분석)	Stemp Cell 기술
TC-10 자동 세포 계수기	바이오 RAD
ROSACreERT2/c-Fos fl/fl Dusp1-/-	집에서 만든
ROSACreERT2/c-Fosfl/fl	집에서 만든
로사크리어트2	잭슨 연구소
C57BL/6	잭슨 연구소
CML-CD34+ 및 일반 CD34+ 셀	신시내티 대학교 대학 병원
LSR II(FACS 분석기)	BD (영어)
Fortessa I(FACS 분석기)	BD (영어)
FACSAriaII(FACS 분류기)	BD (영어)
NAPCO 시리즈 8000 WJ CO2 인큐베이터	써모 사이언티픽
스윙 버킷 로터 cetrifuge 5810R	에펜도르프
1/2 cc Lo-Dose u-100 인슐린 주사기 28 G1/2	벡턴 디킨슨(Becton Dickinson)	벡턴 디킨슨(Becton Dickinson)
하이드로코르티손 나트륨 헤미숙시네이	줄기세포 기술	7904
GM-CSF	프로스펙	CYT-221
G-SCF	프로스펙	CYT-220
인간 IL-3	프로스펙	CYT-210
인간 SCF	프로스펙	CYT-255
에리트로포이에인	암젠	5513-267-10
BD Perm/Wash (phospho flow를 위한 투과화 및 세척 용액)	BD (영어)	554723
BD Cytofix/Cytoperm (고정 및 투과화 솔루션)	BD (영어)	554714
BD 제약 라이즈	BD (영어)	555899
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0.45μM 아크로 디스크 필터	폴	2016-10

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