이 문서는 망막 안료 상피 하나에서 세 일 postfertilization의 배아에게 부착과 않고 zebrafish의 망막 microdissect하는 방법을 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
Zebrafish는 때문에 급속한의 눈 개발에 연구에 인기있는 동물 모델입니다
프로토콜
1 부 : microdissection 전 준비
- 솔루션
- E3 매체 4 (5 MM NaCl, 0.17 MM KCl, 0.33 MM CaCl 2, 0.33 MM MgSO 4).
- 링어의 솔루션 1, 5 (116 MM NaCl, 2.9 KCl MM 1.8 MM CaCl 2, 5 MM HEPES, pH7.2), 필터 살균.
- 5N NaOH.
- 텅스텐 바늘의 화학 에칭
- 점토하여 페트리 접시에 5N NaOH를 포함하는 작은 비커를 확보.
- 그것은 NaOH 용액과 접촉할 수 있도록 비커의 측면에 종이 클립을 부착합니다.
- 종이 클립과 텅스텐 와이어의 짧은 조각 (~ 2cm)의 권력을 긍정적인 전극에 DC 전원 공급 장치의 음극을 연결합니다.
- 작은 점토 공과 텅스텐 와이어의 다른 쪽 끝을 싸서 NaOH 용액에이 끝부분을 찍어.
- 약 3V로 전압을 증가시키고 좋은 에칭 속도가 접수 때까지 NaOH 용액에 철사를 찍어 내려. 좋은 품질의 바늘은 보통 10 분 이내에 에칭 수 있....
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토론
zebrafish 아이 조직의 Microdissection 효과적으로 그대로 망막 및 RPE 연결된 망막을 얻을 수 있습니다. 이것은 실질적으로 특정 안구 조직 (예 : 망막 또는 RPE)에 관한 표현 연구를 지원합니다. 사실, 우리는 성공적으로 전체 망막 1 RPE 3 RNA 발현 프로파일을 얻기 위해이 절차를 이용합니다. 해당 프로필의 유틸리티는 강력 망막 차별 돌연변이에 불안정하게된다 는걸 알수 경로와 유전자 가족의 최근 식별에 의해 지원됩니다. 망막 절개 절차에서 가장 중요한 단계는 RPE 잔존물 제거를위한 압연 포셉 및 조직의 끝으로 빗질 조치하고 있습니다. 우리는 해부 동안 의자에 달려 조정 팔을 팔꿈치를 퍼팅 찾기 실질적으로 원치 않는 손 움직임을 안정 수 있습니다. 또한, 일부 RPE 잔존물은 오라 세라타에 남아있을 수 있습니다. 이 지역은 해부를위한 문화 판의 준수 표면과 접촉 올 수 있기 때문입니다. 그럼에도 불구하고, 대부분의 RPE 세포는 닦고 및.......
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공개 사항
동물 실험은 퍼듀 애니멀 케어 및 사용위원회에 의해 명시된 지침과 규정에 따라 수행되었다.
감사의 글
이 작품은 퍼듀 대학에서 생물학의학과에서 시작 기금에 의해 지원됩니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 무선 유발 모터 | VWR international | 47747-370 | |
| DC 전원 공급 장치 | 라스카(Lascar) | PSU130 | 어떤 DC 전원 공급 장치든 사용 가능합니다. 다른 장비를 사용할 경우, 해당 장비의 특정 전압에 대한 추가적인 최적화가 필요합니다. |
| 일회용 유발봉 &마이크로튜브, 1.5 mL (DNase, RNase 및 파이로젠 프리) | VWR international | 47747-366 | 이것들은 발현 분석을 위한 TRIzol 내 조직 수집에 사용됩니다. |
| Dumont #5 핀셋, 팁: 0.05 x 0.01mm, Inox | World Precision Instruments, Inc. | 500341 | 미세한 팁 치수가 바람직하지만, 때때로 팁을 날카롭게 다듬어야 할 수도 있으므로 반드시 고정되어야 하는 것은 아닙니다. |
| Dumont #5SF 핀셋, 팁: 0.025 x 0.005mm, Inox | Fine Science Tools | 11252-00 | 미세한 팁 크기가 바람직하지만, 때때로 팁을 더 날카롭게 갈아내야 할 수도 있으므로 반드시 이 치수를 엄격하게 고수할 필요는 없습니다. |
| Falcon 폴리스티렌 배양 플레이트, 60 X 15 mm | BD Biosciences | 351007 | 이 플레이트들은 해부용 플레이트로 사용됩니다. |
| Olympus SZX16 실체현미경 | Olympus Corporation | SZX16 | 어떤 실체 현미경이든 사용 가능합니다. 이전 연구에서는 Leica 실체 현미경을 사용하였습니다.1-3 문제없이 진행되었습니다. 또한 2배율 대물렌즈가 설치되어 있음에도 불구하고, 해부 과정에는 1배율 대물렌즈만을 전적으로 사용하였습니다. |
| 숫돌 | Fine Science Tools | 29008-01 | 필요한 경우, 이를 사용하여 핀셋의 끝을 날카롭게 다듬으십시오. |
| 가열 플레이트 | Tokai Hit | MATS-U55SZX2B | 이는 해부 과정 전반에 걸쳐 조직의 온도를 유지하고, 온도 변화가 유전자 발현에 미치는 영향을 최소화하기 위해 사용됩니다. 또한, 현미경 전체를 28℃로 환경 제어되는 실내에 배치하였습니다.°이전 연구들의 해부 과정 중 C1-3 성공적으로. |
| Trizol, 100 mL | Invitrogen | 15596-026 | |
| 텅스텐 와이어, 직경 0.015인치 | World Precision Instruments, Inc. | TGW1510 | |
| 나무 어플리케이터 | 퓨리턴 | 807 | 이는 화학적으로 식각된 텅스텐 바늘을 고정하는 데 사용됩니다. |
참고문헌
- Leung, Y. F., Dowling, J. E. Gene expression profiling of zebrafish embryonic retina. Zebrafish. 2, 269-283 (2005).
- Leung, Y. F., Ma, P., Link, B. A., Dowling, J. E. Factorial microarray analysis of zebrafish retinal development. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, ....
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