髄膜炎菌 (ナノメートル)、グラム陰性ヒト特異的な呼吸器病原体は、ヒトα-アクチニンに結合することができる。ここでは、人間の脳の微小血管内皮細胞(HBMECs)への細菌侵入後のα-アクチニン細胞と細菌のcolocalisationの可視化のためのプロトコルを提示する。
髄膜炎菌 (ナノメートル、髄膜炎菌)のOPCの蛋白質はアドヘシンとヒト上皮および内皮細胞のための効果的なインベイシンとして作用することができる表面発現に不可欠外膜タンパク質、です。我々は、OPC、そのようなビトロネクチンのようなインテグリンのリガンドへの最初のバインドにOPCを必要とするプロセスのための主要な受容体として、これらの細胞に発現受容体1を介して内皮細胞表面にあるインテグリンを同定した。このプロセスは、内皮細胞の細菌の侵入を2につながる。最近では、我々はヒトの細胞3の全細胞溶解物に見られる100kDaタンパク質とOPCとの相互作用を観察した。宿主細胞のタンパク質は電気泳動によって分離し、ニトロセルロースにブロットOPC発現ナノメートルを重ねていたとき私たちは、最初にこの相互作用を観察した。相互作用は直接的であり、中間分子を伴うものではなかった。質量分析法により、我々はα-アクチニンなどの蛋白質のアイデンティティを確立した。ない面が発現していないとして、α-アクチニンは調べた8枚のセルラインのいずれかに発見され、標的細胞への細菌侵入に対する血中鉛の存在下で内皮細胞とOPCの相互作用として、我々は細胞内で相互作用する2つのタンパク質の可能性を検討した。このため、培養ヒト脳微小血管内皮細胞(HBMECsは)長期間と内部化された細菌とα-アクチニンの位置については、OPC発現Nmで感染させた共焦点顕微鏡で調べた。私たちは、細菌の内部化の8時間後にはかなりいた細胞骨格タンパク質、とNmのcolocalisationにおける時間依存増加を観察した。さらに、定量的なイメージングソフトウェアを使用することにより、α-アクチニンと他の細胞骨格タンパク質とナノメートルのcolocalisationの相対的な尺度を得ることができました。手順を実行すると、ヒト上皮細胞にも適用可能であるが、ここでは、ヒト内皮細胞への細菌侵入後の細胞内タンパク質と細菌のcolocalisationの可視化と定量化のためのプロトコルを提示する。
内部化の結合の可能性OPC発現α-アクチニンにナイセリア髄膜炎は、細菌のcolocalisationと3と8時間の潜伏期間の後、感染細胞の細胞骨格蛋白質の検査でHBMECを用いて検討した。共焦点顕微鏡により、α-アクチニンと髄膜炎菌のcolocalisationを実証することができます。細菌を3時間で内在化されたが、特に、、この時点でα-アクチニンと少しcolocalisationなかった。細胞骨格タンパク質と細菌の関連が8時間の感染期間の後に細胞内の居住のより長い期間を必要とするように登場し、細菌のかなりの数には密接に関連して明らかにα-アクチニンを持っていた。 α-アクチニンは多機能タンパク質であり、細胞骨格要素を持つ細菌の相互作用は、現在の研究の対象となる標的細胞の機能に重要な影響を与える可能性があります。
上記のようcolocalisationの定量化は、細心の試料の準備が必要です。特に注意が期間と抗体希釈液をブロックし、試料の固定に与えられるべきである。対雑音比最高の信号の場合は、それぞれプライマリとセカンダリの抗体は、最適な濃度を決定するために予備実験で滴定する必要があります。我々の経験では、封入剤のMowiolは、より良いイメージを作り出した。
The authors have nothing to disclose.
研究はWellcome Trustと髄英国で賄われた。 HBMECの細胞株は、博士KS金によって提供されていました。共焦点イメージングと電子顕微鏡は、ウォルフソンのバイオイメージング施設、ブリストル大学で実施された。我々はまた彼らの支援やアドバイスのために氏アランラード、博士マークジェプソン(ブリストル大学)、そしてアランティリー(パーキンエルマー)を感謝したいと思います。
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
12 well plate | Corning | BC311 | ||
Glass Coverslips | VWR | 631-0152 | ||
BHI AGAR | LAB M | LAB048 | ||
M199 | Sigma | M2154 | ||
RPMI 1640 | Lonza | BE12-167E | ||
MEM Non Essential Aminoacids | Sigma | M7145 | ||
HANK’S balanced salt solution | Sigma | H9269 | ||
FBS | Biowhittaker | DE14-801F | ||
Glutamine | Sigma | G7513 | ||
Sodium pyruvate | Sigma | S8636 | ||
Penicillin-Streptomycin | Sigma | P0781 | ||
MEM Vitamin solution | Sigma | M6895 | ||
PBSB | Lonza | BE17-513F | ||
BSA | Sigma | A9418 | ||
Paraformaldehyde | Fisher | P/0840/53 | ||
Triton X-100 | Sigma | X-100 | ||
DAPI | Sigma | D-9564 | ||
Vectashield | Vector | H-1000 | ||
Mowiol 4-88 | Calbiochem | 475904 | ||
Anti‑Nm antiserum | Laboratory raised | Rabbit serum | ||
TRITC anti-rabbit Ig | Sigma | T6778 | ||
Anti α‑actinin mAb [7H6] | Abcam | Ab32816 | IgG | |
Anti actin mAb | Sigma | A4700 | IgG2a | |
Anti vimentin mAb | Sigma | V6630 | IgG1 | |
ALEXA FLUOR 488 anti‑mouse IgG | Invitrogen | A11001 | ||
FITC anti-mouse IgG | Sigma | F-2012 |
1. Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM):
Leica SP5 confocal imaging system: This system, by using a combination of AOTF (acousto-optical tuneable filter) and an AOBS (acousto-optical beam splitter), simplifies excitation with specific wave lengths.
2-Software:
Leica confocal software LCS, Leica Microsystems, Germany.
Volocity 5, Improvision, PerkinElmer, USA.