Mätning Calpain aktivitet inom fast och levande celler med flödescytometri
Summary
Denna artikel kommer detaljerat protokoll för mätning calpain aktivitet i fasta och levande celler med hjälp av flödescytometri.
Abstract
Calpains finns överallt intracellulära, kalcium-känsliga, neutral cysteinproteaser<sup> 1</sup>. Calpains spela avgörande roller i många fysiologiska processer, inklusive signalsystem, cytoskelettala omdaning, reglering av genuttryck, apoptos och cellcykelreglering<sup> 1</sup>. Calpains har varit inblandade i många sjukdomar inklusive muskeldystrofi, cancer, diabetes, Alzheimers sjukdom och multipel skleros<sup> 1</sup>. Calpain reglering är komplex och ofullständigt känd. mRNA och protein nivåer korrelerar dåligt med aktivitet, begränsa användningen av genen eller proteinuttryck tekniker för att mäta calpain aktivitet. Denna video protokoll detaljer en flödescytometrisk test som utvecklats i vårt laboratorium för mätning av calpain aktivitet i fasta och levande celler. Denna metod använder den fluorescerande substratet BOC-LM-CMAC, som klyvs specifikt av calpain, för att mäta calpain aktivitet.<sup> 2</sup> I den här videon är calpain aktivitet i fasta och levande murina celler 32Dkit leukemi, ensamma eller som del av en splenocyte befolkning mäts med en LSRII (BD Bioscience). 32Dkit celler visat sig ha förhöjd aktivitet jämfört med normala splenocytes.
Protocol
Discussion
Den calpain aktiviteten i fasta och levande 32Dkit celler har fastställts i denna video protokoll. Behandling av cellen linje med calpain hämmare PD150606 resulterade i fullständig hämning av calpain aktiviteten i cellerna. Dessutom resulterade behandling med MEK1 hämmaren PD98059 i fullständig hämning av calpain aktiviteten i cellerna. ERK är en viktig aktivator av calpain-2 3. Dessa resultat tyder på att calpain-2 aktivitet är dominerande i 32Dkit cellerna. Pågående arbete i vårt laboratorium u…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Finansierats med bidrag från den kanadensiska Institutes of Health Research, The leukemi och lymfom Society of Canada och lymfom Foundation of Canada.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| PBS BOC-LM-CMAC 4% paraformaldehyde |
Invitrogen | Dissolve 4g paraformaldehyde in 100mL PBS. In fume hood, heat sample with stirring until clear. Let cool then store at 4°C |
||
| PD150606 | Invitrogen | Use freshly reconstituted PD150606 for maximal calpain inhibition. | ||
| PD98059 | Cell Signaling Technology | |||
| AlignFlow, AlignFlow plus fluorescent beads FACS tubes |
Invitrogen | |||
| LSR II | BD Bioscience | Supernatant of WEHI-3 cells is used as a source of IL-3 in these experiments. Each collection of WEHI-3 supernatant is titrated to determine the optimal concentration used for 32Dkit cell growth. |
References
- Goll, D. E., Thompson, V. F., Li, H., Wei, W., Cong, J. . The Calpain System. Physiol. Rev. 83, 731-801 (2003).
- Niapour, M., Berger, S. A. Flow Cytometric Measurement of Calpain Activity in Living Cells. Cytometry A. 71A, 475-485 (2007).
- Leloup, L., Daury, L., Mazéres, G., Cottin, P. Involvement of the ERK/MAP kinase signalling pathway in milli-calpain activation and myogenic cell migration. The International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 39, 1177-1189 (2007).
