Method Article

플라스미드 DNA의 재조합 독감 바이러스의 생성

DOI:

10.3791/2057

⸱

August 3rd, 2010

 , 
1Department of Microbiology and Immunology, University of Rochester School of Medicine and Dentistry, 2Departments of Microbiology and Medicine, and Global Health and Emerging Pathogens Institute, Mount Sinai School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

플라스미드 DNA의 인플루엔자 바이러스의 구조는 독감 연구자 인플루엔자 바이러스의 생물학의 여러 측면을 연구하는 재조합 바이러스를 생성하고, 잠재적인 벡터 또는 백신으로 사용할 수있는 기본적인 필수 실험 기법입니다.

Abstract

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독감 연구 그룹의 숫자로 노력은 인플루엔자 바이러스 역방향 유전학의 개발과 개선에 중요한되었습니다. 원래 1999 년에 설립

Protocol

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1. 인플루엔자 바이러스 구조 transfection

인플루엔자 바이러스는 부정적 - 표류하는 RNA 싸여 바이러스의 Orthomyxoviridae 제품군에 속한다. 인플루엔자 바이러스 게놈은 적어도 11 바이러스성 단백질 (그림 1) 4 인코딩 부정 극성의 8 개의 RNA의 유전자로 구성되어 있습니다. 우리는 (8 인플루엔자 바이러스 A/PR/8/34 세그먼트를 포함하는 ambisense의 plasmids (pDZ)를 사용하여 가장 일반적인 실험실 변형, 인플루엔자 A/PR/8/34 5 중 하나의 구조에서,이 보고서에서, 초점을 맞출 것이다 그림 2).

플라스미드 DNA의 재조합 독감 바이러스의 구조를 위해, 우리는 각각의 재조합 바이러스 당 3 독립 transfections을 권장합니다. 하나 이상의 재조합 바이러스의 구조를 시도하는 경우, 구조를 바이러스의 수에 accordantly 다음 단계를 수행 규모. 다음 transfection 및 감염 프로토콜은 6 - 잘 접시를 위해 설정됩니다. 프로토콜의 구조 표현은 그림 3에서 그림입니다.

  1. OptiMEM - Lipofectamine 2000 (LPF2000) 혼....

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Discussion

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플라스미드 DNA의 재조합 독감 바이러스의 구조는 프로토콜이 정기적으로 실험실에서 수행되면 간단하고 간단하게,하지만 처음에 여러 일이 잘못 이동할 수 있습니다. 바이러스를 생성하는 좋은 플라스미드 준비를하기 위해 필수적인 그것을 것입니다. 세포 라인 (293T 및 MDCK)의 적절한 유지 관리는 성공적인 바이러스 구조를 위해 중요합니다. 전통적으로, 유전자 태그는 침묵 돌연변이 유발에 의해 플라스미드 인플루엔자 유전자 인코딩에 삽입됩니다. 이 침묵 돌연변이 (S) 및 예를 들어, 창조의 소개, 소설의 제한 효소 사이트는 효소 분해에 의해 야생 - 타입과 재조합 독감 바이러스를 구분하는 데 사용됩니다. 따라서, 재조합 바이러스를 정화 상패의 증폭 후, RT - PCR 및 시퀀싱 방법은 구출 바이러스의 특성을 확인하기 위해 수행되어야합니다. 이러한 역방향 유전학 기술과 plasmids에서 재조합 독감 바이러스의 성공적인 구조의 개발은 바이러스의 생물에 대한 구체적인 질문에 대한 답변을하실 수 있습니다.

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Disclosures

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의학의 마운트시나이 학교는 재조합 독감 바이러스의 영역에서 지적 재산권을 가지고 있으며, AG - S는 지적 재산권의 발명가이다.

Acknowledgements

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저자는 인플루엔자 역방향 유전학 기술과 plasmids의 발전을위한 아돌포 가르시아 - 사스 트레와 피터 Palese 실험실에서 과거와 현재 회원을 감사드립니다. AG - S 실험실의 연구는 부분적으로 CRIP, 인플루엔자 연구 및 감시를위한 우수의 NIAID 투자 센터 (HHSN266200700010C)와 NIAD 보조금 R01AI046954, U01AI070469 및 P01AI058113으로 후원됩니다. LM - S 실험실 연구는 부분적으로 NIAID 부여 RO1AI077719에 의해 후원됩니다.

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Materials

셀 라인

293T (카탈로그 번호 CRL - 11268) 및 MDCK는 (카탈로그 번호 CCL - 34) 세포 라인 DMEM 10% FBS, 1 % PS에서 5 % CO 2와 37 ° C 배양기에서 유지됩니다. 세포는 미국 유형 문화 수집 (ATCC, 10801 유니버 시티대로, 머내서스, VA. 20110-2209 미국) 제공 형태입니다.

Embryonated 닭고기 계란

Embryonated 10 일 된 닭 계란은 찰스 리버 연구소 무균 요금 조류 공급 장치 (SPAFAS) 조류 제품 및 서비스에서 얻을 수 있습니다. 프랭클린 커먼스, 106 루트 32, 노스 프랭클린, CT 06254 미국. 계란은 37 ° C 이전에서, 바이러스 감염 후 incubated 수 있습니다. 바이러스 감염 전후, 계란은 배아의 생존을 결정하는 candled 있습니다. 그것은 바이러스 감염 전후에 죽은 알을 찾기 위해 매우 중요합니다. 감염 전에 죽은 계란은 쉽게 혈관의 부재뿐만 아니라 배아 이동성의 부재에 의해 발견하실 수 있습니다. candled 때, 라이브 배아가 이동합니다. 바이러스 감염 후 죽은 계란은 (아마도 독감 바이러스 감염에 관한) 쉽게 allantoic 유체의 작고 피묻은 볼륨으로 볼 수로 계란의 나쁜 모습으로 발견됩니다. 감염 - 달걀은 두 autoclavable 봉투에 삭제 및 표준 절차에 따라 autoclaved 있습니다.

치킨 적혈구 (RBC)

치킨 RBC는 트러 슬로 팜, 201 밸리로드, 체스터, MD 21620에서 구입할 수 있습니다. 4 스토어 ° C. HA의 assays 들어, 50 ML의 원심 분리기 튜브의 PBS 1X 45 ML과 닭고기 RBC 5 ML 씻는다. 1,000 RPM으로, RT에서 5 분 원심 분리기. 신중하게 뜨는을 취소하고 PBS 1X의 pelleted RBC의 1:1000 희석 (0.5-1.0 % RBC의 최종 농도)를 사용합니다.

조직 문화 supernatants 및 allantoic 유체

, 조직 문화 supernatants 및 allantoic 체액 모두 4 ° C 짧은 기간 동안 저장할 수 있습니다. 바이러스 구조를 확인 후, 세포 supernatants 또는 allantoic 유체의 바이러스는 -80 ° C.에 저장됩니다

Plasmids

모든 plasmids은 플라스미드 맥시 키트의 다음 제조 업체의 권장 사항을 사용하여 준비가되어 있습니다. 모든 plasmids은 ddH 2 O 1 μg / ML의 농도에서 나누어지는되며 -20 ° C.에 저장된 단기 스토리지, 플라스미드는 4 유지할 수 있습니다 ° C.를 플라스미드 정화 DNA의 농도는 순도가 260:280 NM 비율을 사용하여 예상되는, 260 NM에서 분광 광도법에 의해 결정됩니다. 1.8-2.0 NM 260:280 비율로 준비가 바이러스 구조 목적 appropriated 간주됩니다. 또한 플라스미드 농도와 순도는 아가로 오스 겔 크로마 토그래피로 확인되어야합니다. Ambisense pDZ plasmids (6) 8 인플루엔자 바이러스 유전자 A/PR/8/34 (7)이있는 그림 2 그림입니다.

바이러스

독감 A/PR/8/34을 구해준 것에 대해 설명하는 프로토콜은 biosafety 수준 (BSL) 2 조건 하에서 수행할 수 있습니다. 조직 문화 supernatants 및 embryonated 계란을 포함한 오염 물질은, 폐기하기 전에 소독한다. 다른 인플루엔자 바이러스의 구조는 높은 BSL 조건 및, 따라서, 특수 조건 / 보안 측정을 소집해야합니다 필요할 수 있습니다.

조직 문화 미디어 및 솔루션

DMEM 10% FBS 1퍼센트 PS : 445 ML Dulbecco의 수정 이글 배지 (DMEM), 태아 소 혈청 (FBS) 50 ML 및 100X 페니실린 / 스트렙토 마이신 (PS) 5 ML. 4 스토어 ° C. 이 미디어는 transfections에 대한 293T 및 MDCK 세포뿐만 아니라 유지하는 데 사용됩니다. DMEM 0.3 % BA 1퍼센트 PS : DMEM의 495.7 ML, 35% 보빈 알부민 (BA) 4.3 ML. 4 스토어 ° C. 그냥 사용하기 전에, 1 μg / ML의 최종 농도 TPCK 처리 트립신을 추가합니다. 전염성 미디어.

NaCl 80 G, KCl 2 G, 나 2 HPO 4 0.7 H 2 O, KH 2 2g PO 4 11.5 g : 10X 인산은 호수 (PBS)를 버퍼. 최대 1리터에 ddH 2 O를 추가합니다. 7.3으로 산도를 조정합니다. 압력솥으로 소독. 상온에서 보관하십시오.

1X PBS : ddH 2 O.로 희석 10X PBS 1시 10분 상온에서 압력솥과 저장에 의해 소독.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Neumann, G., Watanabe, T., Ito, H., Watanabe, S., Goto, H., Gao, P., Hughes, M., Perez, D. R., Donis, R., Hoffmann, E., Hobom, G., Kawaoka, Y. Generation of influenza A viruses entirely from cloned cDNAs. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 9345-9350 (1999).
  2. Fodor, E., Devenish, L., Engelhardt, O. G., Palese, P., Brownlee, G. G., Garcia-Sastre, A.

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Recombinant Influenza VirusPlasmid DNA TransfectionHA AssayMDCK CellsChicken Embryonated EggsTissue Culture SupernatantCytopathic EffectTPCK TrypsinOpti MEM MediaLipofectamine 2000

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