We beschrijven een methode voor het herhaaldelijk het visualiseren van muriene microglia en circulerende monocyten<em> In vivo</em> Meer dan uren, dagen of weken met behulp van transcraniële twee-foton microscopie. We laten zien hoe je een verdunde-schedel venster dat intermitterende observatie van latente microglia die kunnen worden geactiveerd door aangrenzende stereotactische injectie van de HIV-1 regulatie-eiwit Tat mogelijk voor te bereiden.
Traditioneel in de neurowetenschappen, in vivo twee foton beeldvorming van de muizen centrale zenuwstelsel heeft of betrokken het gebruik van open-schedel 1,2 of verdund-schedel drie preparaten. Terwijl de open schedel techniek is zeer veelzijdig, is het niet optimaal is voor het bestuderen van microglia want het is invasief en kan leiden tot microgliale activatie. Hoewel de verdunde-schedel aanpak is minimaal invasief, de herhaalde re-dunner worden van de schedel die nodig zijn voor chronische beeldvorming verhoogt het risico van weefselbeschadiging en microglia activatie en zorgt voor een beperkt aantal van beeldvorming sessies. Hier presenteren wij een chronische dunne-schedel venster methode voor de controle muizen microglia in vivo over een langere periode van tijd met behulp van twee-foton microscopie. We laten zien hoe je een stabiel, toegankelijk, verdunde-schedel corticale venster (TSCW) te bereiden met een apposed glazen dekglaasje dat blijft doorschijnend in de loop van drie weken onderbroken observatie. Dit TSCW voorbereiding is veel meer immunologisch inert met betrekking tot de microglia activatie dan open craniotomie of herhaalde schedel dunner en kan een willekeurig aantal beeldvorming sessies gedurende een periode van weken. We bereiden TSCW in CX 3 CR een GFP / + muizen 4 tot en met microglia visualiseren met verbeterde groen fluorescerend eiwit tot ≤ 150 um onder de pial oppervlakte. We tonen ook aan dat deze voorbereiding kan worden gebruikt in combinatie met stereotactische hersenen injecties van de HIV-1 neurotoxische eiwit Tat, grenzend aan de TSCW, die in staat is om duurzaam microgliosis. Daarom is deze methode uitermate geschikt voor de behandeling van veranderingen in de microgliacellen morfologie en beweeglijkheid loop van de tijd in het levende brein in modellen van HIV-geassocieerde Neurocognitieve Disorder (HAND) en andere neurodegeneratieve ziekten met een neuro-inflammatoire component.
Er is een groeiende consensus dat de werkelijke substraat voor HIV-1 geassocieerd neurocognitieve tekorten (HAND) is de vernietiging van synaptische architectuur, vermoedelijk veroorzaakt door pro-inflammatoire mediatoren vrij van HIV-1 geïnfecteerde mononucleaire fagocyten. Microgliale activatie, meerkernige reuscellen, en gliosis te wijten aan astrocytaire hypertrofie worden beschouwd als niet-specifieke kenmerken van HIV-1 infectie en ontsteking in het CZS 7. In tegenstelling, is de ernst van premortem neurologische ziekte in verband gebracht met het verlies van synaptische complexiteit, evenals macrofaag last in het CZS 8,9,10,11. Echter, dynamische interacties tussen de microglia, perifere infiltreren macrofagen en neuronen bij patiënten met HAND kan gewoon niet worden gemodelleerd met behulp van conventionele statische verwerking verkregen uit conventionele immunocytochemische studies. Recente studies van onze laboratoria hebben gesuggereerd dat ten minste enkele van deze interacties tussen perifere en centrale mononucleaire cellen en neuronen kan worden gemodelleerd voor een deel door de stereotactische injectie van de HIV-1-eiwit Tat 1-72 in de hersenen parenchym (Lu, Marker, Tremblay, Qi, en Gelbard, ongepubliceerde gegevens). We hebben daarom besloten om toe te passen in vivo twee foton beeldvorming om de wisselwerking tussen monocyt-afgeleide macrofagen, de hersenen inwoner microglia en neuronen te onderzoeken, in een handelbaar klein diermodel voor neuroAIDS. Terwijl open schedel of verdund-schedel voorbereidingen veroorloven een onderzoek van de corticale architectuur voor een korte periode van tijd (uur), de onderzoekers geïnteresseerd zijn in het tijdsverloop van subacute gebeurtenissen kunnen niet deze preparaten te gebruiken, zonder artifactually te activeren microglia / macrofaag als gevolg van chirurgische manipulatie van de calvarial venster. Hier laten we zien op een eenvoudige manier te omzeilen deze beperking door lijmen een klein stukje glas dekglaasje over het verdunde schedel gebied voorkomen dat de calvarium van regeneratie in de TSCW alsmede het onderhouden van doorzichtigheid gedurende ≥ 3 weken. We verder aan te tonen dat deze techniek ons in staat stelt om het gedrag van de perifere monocyten invoeren van cerebrale microvasculatuur evenals de hersenen-inwoner microglia monitor in reactie op de stereotactische injectie van HIV Tat 1-72 in de cortex van muizen heterozygoot voor CX 3 CR 1 / GFP ( te identificeren cellen van mononucleaire afkomst). Deze techniek kan gemakkelijk worden aangepast voor gebruik op muizen met verschillende genetische achtergronden, bijvoorbeeld, hebben we regelmatig gebruik van heterozygote CX 3 CR 1 / GFP X Thy-1 YFP 12 muizen om de interacties tussen monocyt-afgeleide macrofagen, de hersenen inwoner microglia en neuronen in onderzoeken in vivo modellen van ontstekingsprocessen die relevant zijn voor HAND. Onze TSCW voorbereiding kunnen de onderzoekers om te studeren cel-cel interacties tussen de periferie en CZS die kunnen optreden over periodes van weken, waarin het dier meerdere malen kan worden afgebeeld voor en na de experimentele behandeling. Zo kan elk dier dienen als zijn eigen controle. Een waarschuwing voor deze TSCW model is dat de doelwitcellen in onderzoek moeten worden, hetzij genetisch gemanipuleerd om verbeterde fluorescerende eiwitten (eXFP) te uiten of geëtiketteerd worden met een fluorescerende kleurstof, zonder mechanische schending van de calvarium, en dat eXFP meningsuiting moet robuust genoeg zijn om laten cellulaire architectuur gevisualiseerd na herhaalde beeldvorming sessies over een periode van weken.
The authors have nothing to disclose.
Wij danken Emily A. Kelly voor het hoofd plaat design.
We zijn dankbaar voor de ondersteuning van de NIH awards uit aan HAG: PO1 MH64570, RO1 MH56838, RO1 MH078989, R21 MH03851 en de genereuze steun van de Geoffrey Waasdorp Kinderneurologie Fonds, zonder dat dit werk niet mogelijk zou zijn geweest. AKM wordt gefinancierd door de NIH (EY019277), Whitehall Stichting, de Alfred P. Sloan Foundation en een Career Award in de Biomedische Wetenschappen aan de Burroughs Wellcome Fund. MET wordt gefinancierd door een Fonds de la recherche en sante du Quebec (FRSQ) post-doctorale opleiding award. DFM is een stage in het Medisch Scientist Training Program, gefinancierd door NIH T32 GM07356 en T32 AI049815.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Fentanyl Citrate | Hospira | |||
Midazolam hydrochloride | Baxter | |||
Medetomidine hydrocholoride (Domitor) | Pfizer | |||
Heating pads | Beyond Bodi Heat | |||
Tobramycin and dexamethasone ophthalmic ointment (TobraDex) | Alcon | |||
Povidone-iodine 10% solution | Betadine | |||
Ferric chloride 10% solution | Ricca Chemical Company | 3120-32 | ||
Methyl cyanoacrylate 910 | Permabond | |||
Cyanoacrylate 454 | Loctite | |||
TEETS denture material crosslinking methyl methacrylate | Co-Oral-lte Dental Mfg CO | |||
Microtorque II handpiece kit | Pearson | R14-0002 | ||
IRF 007 drill bits | Fine Science Tools | 19008-07 | ||
Norland bendable microblade full radius | Salvin Dental | BLAD-NORLAND-69 | ||
Cyanoacrylate | The Original Superglue | |||
#0 glass coverslip | Electron Microscopy Sciences | 63750-01 | ||
10 μl Microvolume syringe | World Precision Instruments | ILS010LT | ||
UltraMicroPump III | World Precision Instruments | UMP3-1 | ||
35 gauge NanoFil needle | World Precision Instruments | NL35BL-2 | ||
Ball Mill, Carbide bits #1/4 | World Precision Instruments | 501860 | ||
Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-100 | ||
Photomultiplier tube | Hamamatsu | HC125-02 | ||
Ti:Sapphire laser Mai-Tai | Spectra-Physics |