En este material de vídeo y complementaria, se muestra un protocolo para la crónica<em> In vivo</em> Imágenes del cerebro intacto con una preparación diluida-cráneo.
Abstract
Imágenes in vivo utilizando dos fotones microscopía de barrido láser (2PLSM) permite el estudio de las células vivas y los procesos neuronales en el cerebro intacto. La técnica que aquí se presenta permite que la imagen de la misma área del cerebro en varios puntos del tiempo (crónica de imágenes) con resolución microscópica que permite el seguimiento de las espinas dendríticas, que son las pequeñas estructuras que representan la mayoría de los sitios postsinápticos excitatorios en el SNC. La capacidad de resolver bien claramente las estructuras corticales más de varios puntos del tiempo tiene muchas ventajas, especialmente en el estudio de la plasticidad del cerebro en la que los cambios morfológicos en las sinapsis y la remodelación del circuito puede ayudar a explicar los mecanismos subyacentes. En este material de vídeo y complementarias, se muestra un protocolo para la crónica en vivo de imágenes del cerebro intacto con una preparación diluida-cráneo. La preparación diluida-cráneo es un método mínimamente invasivo, lo que evita posibles daños a la duración y / o la corteza, lo que reduce la aparición de una respuesta inflamatoria. Cuando este protocolo se realiza correctamente, es posible seguir con claridad los cambios en las características de la espina dendrítica en el cerebro intacto durante un período prolongado de tiempo.
Protocol
Para visualizar las neuronas en el cerebro intacto utilizando microscopía de dos fotones, una preparación donde las neuronas son etiquetados con marcadores fluorescentes se utiliza. En los experimentos que aquí se presenta se utiliza la línea de las buenas prácticas agrarias-M de ratones transgénicos que las etiquetas de la capa de células piramidales 5 1. Capa 5 células piramidales proyecto prolongaciones dendríticas en las capas superficiales, lo que permite la visualización de las dendritas y espinas dendrítica…
Discussion
Imágenes crónica utilizando microscopía de dos fotones se está convirtiendo en una técnica cada vez más popular para estudiar los cambios morfológicos se dispararon durante 2-5 plasticidad. Aquí se demuestra una preparación diluida-cráneo de seguir identificado las espinas dendríticas en el cerebro del ratón intacto en día imágenes diferentes. En este protocolo, el cráneo se deja intacta, causando el mínimo daño a la corteza y que resulta en niveles muy bajos de la neuroinflamación que puede…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el Premio Carrera Burroughs Wellcome en las Ciencias Biomédicas (AKM), la Fundación de Becas de Investigación Whitehall (AKM), Beca de la Fundación Sloan (AKM), NIH EY019277 (AKM), y una financiación NEI, Visión Entrenamiento Grant, EY013319 ( EAK).
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
Fentanyl Citrate
In-house pharmacy
Fentanyl Cocktail: Anesthesic Cocktail;
IP Dose: 0.0125 ml/g
Final cocktail conc.: 0.05 mg/kg
Medetomindine Hydrochloride
In-house pharmacy
Fentanyl Cocktail: Anesthesic Cocktail;
IP Dose: 0.0125 ml/g
Final cocktail conc.: 0.05 mg/kg
Midazolam HCL
In-house pharmacy
Fentanyl Cocktail: Anesthesic Cocktail;
IP Dose: 0.0125 ml/g
Final cocktail conc.: 0.05 mg/kg
2,2,2-tribromoethanol
Avertin Cocktail: Anesthetic;
IP Dose: 0.0075 cc/ g
Final cocktail conc.: 1%
2-methyl-2-butanol (Final concentration: 0.775%)
Avertin Cocktail: Anesthetic;
IP Dose: 0.0075 cc/ g
Final cocktail conc.: .775%
TC-1000 Temp. Control System for Mice
CWE, Inc.
TC-1000 Mouse
Body Temp. Regulation
Toberadex
In-house pharmacy
Eye Ointment
10% Ferric Chloride
Ricca Chemical, Inc.
3120-32
Thin-skull preparation
Microsurgical Blade
Sable Industries
S-6400
Thin-skull preparation
Cyanoacrylate 404,401
Loctite
P/N 46551
Thin-skull preparation
Cyanoacrylate 401
Loctite
P/N 40140
Thin-skull preparation
Zip Kicker Glue Accelerator
Pacer Technology
PT-29
Thin-skull preparation
Micro Drill Steel Burrs 0.7mm tip diameter
Fine Science Tools
19008-07
Thin-skull preparation
Microtorque Control Box and Tech2000 Handpiece
Ram Products, Inc.
TECH2000ON/OFF
Thin-skull preparation
#6-0 (0.7 metric ) silk suture
Ethicon
K8894H
Taper C-1
Eye Dressing Forceps, 10cm, tip width 0.5mm, curved
Surgical Tools
Fine Science Tools
11152-10
Extra Fine Bonn Scissors, 8.5cm, straight tip, cutting edge 13mm
Surgical Tools
Fine Science Tools
14084-08
Standard Pattern Forceps, straight, 2.5mmx1.35mmtip, 12cm
Kelly, E. A., Majewska, A. K. Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation. J. Vis. Exp. (44), e2060, doi:10.3791/2060 (2010).