IP – FCM法は、遺伝子工学や大規模なサンプルサイズを必要とせず、天然のタンパク質 – タンパク質相互作用の敏感な、堅牢な、生化学的評価を可能にする、提示される。
フローサイトメトリー(IP – FCM)によって検出された免疫沈降はタンパク質 – タンパク質相互作用を検出および定量するための効率的な方法です。基本的な原理は、キャプチャされた主な分析対象物が物理的に多タンパク質複合体の中で関連する他の分子と一緒に検出できる特徴と、サンドイッチELISAのことを拡張します。手順は、細胞ライセートでこれらのビーズをインキュベート蛍光標識プローブで捕捉タンパク質複合体をプロービングし、フローサイトメトリーによってビーズに関連した蛍光を分析する、目的のタンパク質に特異的なモノクローナル抗体(mAb)を免疫沈降したポリスチレンラテックスビーズの共有結合を含む。 IP – FCMは、非常に敏感であり、そのネイティブ(非変性)状態でのタンパク質の解析を可能にし、どちらかの半定量的または定量分析に適している。追加の利点として、IP – FCMは、フローサイトメーター以外の遺伝子工学や特殊な機器を、必要としない、そしてそれは容易に高スループットのアプリケーションに適合させることができる。
タンパク質 – タンパク質相互作用に関する情報は、このようなシグナル伝達、系統の成熟、細胞周期の進行、およびアポトーシスのカスケードのような多くの細胞プロセスの分析との関連性が高いです。 IP – FCMは、タンパク質の相互作用を調べたり、その本来のコンフォメーションで多タンパク質複合体のメンバーを定義するために、迅速な定量的、かつ高感度な方法を提供します。ビーズが結合し、細胞溶解物と共にインキュベートした一日にしてプローブと次の日に分析することができますすることができます。 96ウェルプレートフォーマットでは、統計的またはスクリーニングpurposesのために効率的なデータ収集を提供するために、一度に分析するサンプルの大規模な数値を可能にする。蛍光ビーズの基準を使用して、それぞれのビーズによって捕捉されたタンパク質の数を推定することができる。非常に小さなソースの材料は、捕捉および検出のために必要ですので、限られたサンプルと希少な検体は、依然として、複数の相互作用を分析することができます。 IP – FCMは、非生理的環境でのタンパク質の遺伝子工学、エピトープタギング、変性、またはインビトロでのミキシングを必要としないが、それはそれへの適用性を持つ貴重なとアクセス可能なツールとなって、これらと他の技術と組み合わせて使用することができます多くの生物学的システム。
トラブルシューティング:
多くのIP – FCMの実験では、有用なタンパク質相互作用のデータに彼らが試みている初めてを生成します。しかし、IP – FCMの最適化は、ビーズ、タンパク質複合体のキャプチャ、および結合性蛍光プローブに抗体結合を向上させることができます。
IP抗体結合の効率は、抗免疫グロブリン抗体と直接結合したビーズをプローブによって決定することができる。この効率性が低い場合は、カップリング反応時の抗体の濃度を増加させるとより多くのIP抗体は、それぞれのビーズに接続できるようにすることができます。これは、分析対象物の拡張された捕捉および検出の結果、IPビーズバッチの結合容量を増やすことができます。これらはビーズ添付ファイルと低い抗体の結合の結果のモノクローナル抗体と競合できるように他の主要なアミン含有分子(例えば、トリス、ウシ血清アルブミン)は、カップリング反応の間に存在すべきではない。ビーズへの抗体の結合は、他の理由から問題が判明した場合、ビーズの代わりにアビジン/ストレプトアビジンに結合することができ、そしてビオチン化抗体は、その後に非共有結合とimmunprecipitationに使用することができます。
良い抗体結合にもかかわらず、ビーズ関連蛍光の最初の検出は、低い可能性があります。最初に、複雑なキャプチャ自体は低いかもしれない。 IP – FCMは、ユニットの溶解体積あたりの溶解した細胞の数を増やし、検体の濃度に依存するため、分析物捕捉および検出を向上させることができます。さらに、キャプチャは、キャプチャが少ないビーズ間の複合体、およびプローブビーズ当たりの増加の平均蛍光の結果を配布ライセート、とインキュベートIPビーズの数を減らすことで改善されることがあります。第二に、それは、キャプチャされた複合体へのプローブの抗体のアクセスが立体的に免疫沈降抗体によって阻害されている可能性があります。この場合、問題は、および/またはプローブをキャプチャする別の抗体を使用して対処することができます。
この作品は、イーグルスイノベーションアワード(イーグルスの友愛会)でとメイヨー財団によってサポートされていました。
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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carboxylate-modified polystyrene latex (CML) beads (5mm surfactant-free) | Reagent | Interfacial Dynamics Corporation/Molecular Probes | 2-5000 | Store at 4°C. |
Rainbow Calibration Particles | Reagent | Spherotech, Inc. | RCP-30-5A | Store at 4°C. |
2-[N-Morpholino] ethanesulfonic acid (MES) | Reagent | Sigma | M-5287 | |
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropl) carbodiimide HCl (EDAC) | Reagent | Pierce Sigma |
22980 E-6383 |
Store at -20°C under desiccating conditions. |
Protease Inhibitor General Use Cocktail, containing AEBSF, Bestatin, Aprotinin, EDTA, E-64, and Leupeptin | Reagent | Sigma | P-2714 | Prepare 100x stock solution in H2O. Aliquot and store at -20°C. Handle with gloves. |
PCR plates, 96-well 0.2mL, natural, tall chimney | Reagent | Fisher | 08-408-230 | For use in place of microcentrifuge tubes during FCM staining |