Langendorff मोड के साथ संयोजन के रूप में पृथक दिल छिड़काव,<sup31></sup> पी एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी, एक प्रयोग में जैव रसायन और फिजियोलॉजी के क्षेत्रों को जोड़ती है. प्रोटोकॉल उच्च ऊर्जा फॉस्फेट सामग्री और जबकि समवर्ती शारीरिक समारोह की निगरानी दिल में कारोबार के गतिशील माप के लिए अनुमति देता है. जब सही ढंग से प्रदर्शन किया, इस हृदय energetics के मूल्यांकन में एक महत्वपूर्ण तकनीक है.
Bioengineered माउस मॉडल शक्तिशाली अनुसंधान उपकरण आणविक परिवर्तन और मॉडल के बीच हृदय रोग के कारण रिश्तों के निर्धारण में बन गए हैं. हालांकि आणविक जीव विज्ञान संकेतन मार्ग में महत्वपूर्ण परिवर्तनों की पहचान करने में आवश्यक है, यह कार्यात्मक महत्व के लिए एक किराए की नहीं है. जबकि फिजियोलॉजी समारोह के प्रश्न के उत्तर प्रदान बरकरार में चयापचयों का जैव रासायनिक आकलन के साथ शरीर क्रिया विज्ञान के संयोजन कर सकते हैं, दिल की धड़कन हृदय समारोह और energetics की एक पूरी तस्वीर के लिए अनुमति देता है. सालों के लिए, हमारी प्रयोगशाला पृथक दिल perfusions परमाणु चुंबकीय अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपी (एनएमआर) के साथ संयुक्त इस कार्य को पूरा उपयोग किया गया है. वाम ventricular समारोह Langendorff मोड पृथक दिल perfusions द्वारा मूल्यांकन किया है जबकि हृदय energetics प्रदर्शन द्वारा मापा जाता है<sup31></supPerfused दिलों> पी चुंबकीय अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपी. इन तकनीकों के साथ, phosphocreatine और एटीपी के स्तर के साथ संयोजन में हृदय समारोह के सूचकांक दिलों की धड़कन में एक साथ मापा जा सकता है. इसके अलावा, इन मानकों जबकि शारीरिक या वैकृत तनाव का गठन कर रहे हैं नजर रखी जा सकता है. उदाहरण के लिए, ischemia / reperfusion या उच्च कार्यभार चुनौती प्रोटोकॉल को अपनाया जा सकता है. बैंडिंग महाधमनी या हृदय विकृति के अन्य मॉडलों के उपयोग के रूप में अच्छी तरह से उपयुक्त हैं. प्रोटोकॉल के भीतर वेरिएंट के बावजूद, ट्रांसजेनिक माउस मॉडल के आणविक संशोधनों के कार्यात्मक और ऊर्जावान महत्व पर्याप्त रूप से हो, में वर्णित किया जा जुड़े enzymatic और चयापचय रास्ते में नए अंतर्दृष्टि के लिए अग्रणी. इसलिए,<sup31></sup> पी एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी पृथक perfused दिल में हृदय रोग के पशु मॉडल में एक मूल्यवान अनुसंधान तकनीक है.
31 पी एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी Langendorff perfused पृथक माउस दिल में विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य डेटा प्रदान करता है 3. 4, हालांकि, यह जरूरी है कि महाधमनी और एल.वी. गुब्बारे की प्रविष्टि का cannulation ठीक से ऐसे कर रहे हैं स्थिर हृदय प्रदर्शन की अनुमति है जबकि एनएमआर अंदर ट्यूब. इसके अलावा, तापमान विनियमन सर्वोपरि है क्रम में करने के लिए समुचित आधारभूत समारोह को प्राप्त करने. अच्छा, analyzable एनएमआर स्पेक्ट्रा प्राप्त करने में एक महत्वपूर्ण कारक शोर अनुपात करने के लिए संकेत बढ़ती जा रही है. यह सुनिश्चित करने के इष्टतम "ट्यूनिंग" और नमूना पर "shimming" द्वारा प्राप्त किया जा सकता है. प्रोटोकॉल पाठ में उल्लेख किया है, एक मानक नमूना पूर्व दिल की प्रविष्टि का उपयोग इस सुविधा कर सकते हैं. यह भी उपयोगी है एक पर्याप्त आकार "नमूना" है. कम से कम 100 मिलीग्राम वजन दिल आमतौर पर कम पीसीआर और एटीपी संकेतों तो अधिग्रहण के समय में बढ़ जाती है अच्छा फॉस्फोरस स्पेक्ट्रा प्राप्त करने के लिए आवश्यक हो जाएगा प्रदान करते हैं.
मौजूदा प्रोटोकॉल को संशोधित करने के लिए अतिरिक्त हृदय समारोह और energetics के बारे में जानकारी जुटाने के लिए कई तरीके हैं. हमारी प्रयोगशाला में, हम मिश्रित सब्सट्रेट buffers है जो फैटी एसिड के विभिन्न संयोजनों (निम्न और उच्च सांद्रता में) लैक्टेट, ketones, और इंसुलिन की उपस्थिति शामिल कर सकते हैं के साथ दिल perfused है. छिड़काव बफर में स्थिर आइसोटोप का उपयोग (यानी, 13 सी substrates लेबल) के साथ, हम लेबल acetyl सीओए के रिश्तेदार TCA चक्र के लिए अपने योगदान के द्वारा सब्सट्रेट उपयोग का अनुमान करने की क्षमता के अधिकारी इस आवेदन के लिए 5-7 ., हम isotopomer प्रदर्शन 13 सी एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी के साथ 13-C3 और ग्लूटामेट 13-C4 का विश्लेषण . यह जरूरी छिड़काव प्रोटोकॉल के अंत में दिल फ्रीज clamping और जमे हुए ऊतक के एक निष्कर्षण प्रदर्शन. यह एक अतिरिक्त प्रयोग के रूप में विश्लेषण अलग सेटअप मानकों के साथ एक अलग जांच के उपयोग की आवश्यकता हो जाएगा. अन्य अनुप्रयोगों बफर में deoxyglucose साथ ग्लूकोज के प्रतिस्थापन शामिल है, जबकि 2-31 पी एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग कर दिल में फॉस्फेट deoxyglucose के समय पर निर्भर संचय की निगरानी है. इस विधि दौरे ग्लूकोज तेज की माप के लिए अनुमति देता है 7, 8 इसके अलावा, हमारी प्रयोगशाला कार्डियक समारोह और छिड़काव ischemia / reperfusion और उच्च कार्यभार चुनौती का मिलकर प्रोटोकॉल में energetics विश्लेषण किया गया है. 6 , 8-10.
सारांश में, 31 पी एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी पृथक माउस दिलों में एक तकनीकी चुनौतीपूर्ण प्रक्रिया के अत्याधुनिक उपकरणों का उपयोग की आवश्यकता है. हालांकि, डेटा है कि यह पैदावार शोधकर्ता, जो समारोह और bioengineered माउस मॉडल की energetics का विश्लेषण करना चाहते हैं के लिए अमूल्य है. हमारी प्रयोगशाला के लिए, इन तकनीकों हृदय समारोह, energetics, और चयापचय पर तनाव की एक किस्म के परिणामों की हमारी समझ में महत्वपूर्ण गया है 1, 11 12 .
The authors have nothing to disclose.
लेखकों के लिए उसके समर्थन के लिए एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी भाग के दौरान प्रयोग के Lynne स्पेंसर का शुक्रिया अदा करना होगा. यह काम स्वास्थ्य निधि R01 HL059246 के राष्ट्रीय संस्थानों, HL067970 R01, R01 (डॉ. Tian) HL088634 और HL096284 F32 (डा. Kolwicz) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number |
Magnesium Sulfate | Reagent | Sigma Aldrich | M7506 |
EDTA | Reagent | Sigma Aldrich | E1644 |
Potassium chloride | Reagent | Sigma Aldrich | P4505 |
Sodium bicarbonate | Reagent | Sigma Aldrich | S6297 |
Sodium chloride | Reagent | Sigma Aldrich | S7653 |
Calcium chloride dihydrate | Reagent | Sigma Aldrich | C5080 |
D-Glucose | Reagent | Sigma Aldrich | G7528 |
Sodium Pyruvate | Reagent | Sigma Aldrich | P2256 |
Bruker Ultrashield 600WB Plus | Equipment | Bruker | |
PowerLab 4/30 | Equipment | ADInstruments | ML866/P |
LabChart 6 Pro | Equipment | ADInstruments | MLS260/6 |
Quad Bridge Amp | Equipment | ADInstruments | ML224 |
STH Pump Controller | Equipment | ADInstruments | ML175 |
Minipuls 3 Peristaltic Pump | Equipment | ADInstruments | ML172 |
Disposable BP Transducer | Equipment | ADInstruments | MLT0699 |
10mm NMR Sample Tube | Equipment | Wilmad LabGlass | 513-7PP-7 |
Polyethylene tubing PE10 | Equipment | Becton-Dickinson | 427401 |
Physiological Pressure Transducer | Equipment | ADInstruments | MLT844 |
Polyethylene tubing PE50 | Equipment | Becton-Dickinson | 427411 |
Micrometer syringe | Equipment | Gilmont Instruments | GS-1101 |
McPherson Forceps | Equipment | Miltex Inc. | 18-949 |
Castraviejo microscissors | Equipment | Roboz Surgical Instruments | RS-5650 |
Neoptix Signal Conditioner | Equipment | Neoptix, Inc. | Reflex – 1 |