, בידוד והעשרה, ותחזוקה של גזע תאים מדולובלסטומה
Summary
פרוטוקול זה מתאר את הבידוד, העשרה, ותחזוקה של הגידול מדולובלסטומה בתאי גזע שמקורם בעכברים מוטנטים עם פעילות חוץ רחמי מסלול סוניק הקיפוד.
Abstract
גידולים במוח הוצעו להחזיק אוכלוסייה קטנה של תאי גזע הם שורש tumorigenesis. מבחני Neurosphere אומצו בדרך כלל ללמוד את טבעו של בתאי גזע עצביים, כולל אלו שמקורם ברקמות נורמליות tumorous. עם זאת, כמות ניכרת של התמיינות ומוות התא נפוצים neurospheres תרבותי בשל סביר מצב תת אופטימלי כגון נגישות של כל התאים בתוך אגרגטים בתחום התרבות עד בינוני.
מדולובלסטומה, הנפוצים ביותר בגידול ילדים CNS, מאופיינת בהתקדמות המהירה שלה נטייה להתפשט לאורך הציר מוח השדרה שלם עם התוצאה הקלינית העגומה. מדולובלסטומה היא גידול neuroepithelial של המוח הקטן, והיוו 20% ו -40% של גידול תוך גולגולתי ו הפוסות האחורי בילדות, בהתאמה 1. עכשיו זה מבוססת היטב כי ששש איתות מעודד ריבוי cerebellar נוירון מבשרי גרגיר (CGNPs) במהלך הפיתוח cerebellar 2-4. מחקרים רבים באמצעות מודלים העכבר, שבו מסלול ששש מופעל constitutively, מצאו קשר איתות ששש עם מדולובלסטומה 5-9.
דו"ח האחרונות הראו כי תת קבוצה של תאים שמקורם מדולובלסטומה Patched1 עכברים LacZ / + הם גזע סרטניים בתאים, אשר מסוגלים ליזום propogating גידולים 10. כאן אנו מתארים שיטה יעילה לבודד, להעשיר ולתחזק בתאי גזע סרטניים שמקורם מודלים העכבר כמה מדולובלסטומה, עם מסלול ששש מופעל constitutively עקב מוטציה והחליק (11, hereon כאמור SmoM2), GPCR כי הוא קריטי עבור ששש מסלול ההפעלה. ברקמת כל מדולובלסטומה מבודדים, הצלחנו להקים מושבות שגשוג רבים מאוד. תאים אלה הביעו וחסונה בתאי גזע עצביים מספר סמנים כגון Nestin ו Sox2, יכול לעבור קטעים סדרתי (יותר מ 20) והיו clonogenic. בעוד גזע אלה תאים בתרבית הגידול היו קטנות יחסית, bipoar לעתים קרובות עם גרעיני גבוהה יחס cytoplasmic כאשר בתרבית בתנאים לטובת צמיחה תא גזע, הם שינו באופן דרמטי את המורפולוגיה שלהם, הוארך תהליכים תאיים רבים, שטוח ונסוג מן מחזור התא על מעבר לתא בינוני תרבות בתוספת סרום 10% שור העובר. וחשוב יותר, אלה בתאי גזע סרטניים הבדיל לתוך Tuj1 + + או NeuN נוירונים, האסטרוציטים GFAP + + ו oligodendrocytes CNPase, ובכך הדגשת עוצמה מרובה שלהם. יתר על כן, תאים אלה מסוגלים הפצת medulloblastomas משני כאשר מושתלים orthotopically לעכברים המארח.
Protocol
Discussion
אנו מתארים דרך יעילה לבודד, להעשיר ולתחזק גזע מדולובלסטומה תאים מרקמת הגידול הראשוני שנמצאו בעכברים עם מוטציה פעיל constitutively הקיפוד איתות. מצאנו כי צעד קריטי בהצלחה בהקמת גידול בריא קו תא גזע הוא הטיפול Accutase שימוש במהלך דיסוציאציה של רקמת הגידול הראשוני. מניסיוננו, כא…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי תרומות של ונדרבילט Ingram-Cancer Center תמיכה גרנט (P30 CA068485), המוח ילדות קרן גידול לבין המכון הלאומי לבריאות (NS042205).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103049 | ||
| hEGF | Invitrogen | PHG0311 | 25ng/ml | |
| bFGF | Invitrogen | PHG0023 | 25ng/ml | |
| N2 | Invitrogen | 17502048 | 1X | |
| B27(-RA) | Invitrogen | 12587010 | 1X | |
| Accutase | Invitrogen | A1110501 | 50% | |
| Gelatin | Sigma | G1393 | 0.1% | |
| Glutamine | Invitrogen | 25030081 | 2mM | |
| Primaria dishes | Fisher | 087724C | ||
| Sox2 antibody | Millipore | MAB4343 | Mouse, 1:1000 | |
| Nestin antibody | DSHB | rat401 | Mouse, 1:200 | |
| YFP antibody | Molecular Probes | A11122 | Rabbit, 1:2000 | |
| GFAP antibody | Neuromics | CH22102 | Chicken, 1:1000 | |
| Tuj1 antibody | Sigma | T5076 | Mouse, 1:2000 | |
| NeuN antibody | Millipore | MAB377 | Mouse, 1:2000 | |
| CNPase antibody | Millipore | MAB326 | Mouse, 1:1000 |
References
- Rossi, A., Caracciolo, V., Russo, G. Medulloblastoma: From Molecular Pathology to Therapy. Clin Cancer Res. 14 (4), 971-971 (2008).
- Wechsler-Reya, R. J., Scott, M. Control of Neuronal Precursor Proliferation in the Cerebellum by Sonic Hedgehog. P. Neuron. 22 (1), 103-103 (1999).
- Dahmane, N., Ruiz, A., Altaba, I. Sonic hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum. Development. 126 (14), 3089-3089 (1999).
- Wallace, V. A. Purkinje-cell-derived Sonic hedgehog regulates granule neuron precursor cell proliferation in the developing mouse cerebellum. Curr Biol. 9 (8), 445-445 (1999).
- Fan, X., Eberhart, C. G. Medullablastoma Stem Cells. J Clin Oncol. 26 (17), 2821-2821 (2008).
- Yoon, J. W., Gilbertson, R., Iannaccone, S. Defining a Role for Hedgehog Pathway Activation in Desmoplastic Medulloblastoma by Identifying GLI1 Target Genes. International journal of cancer. 124 (1), 109-109 (2009).
- O’Dorisio, M. S., Khanna, G., Bushnell, D. Combining anatomic and molecularly targeted imaging in the diagnosis and surveillance of embryonal tumors of the nervous and endocrine systems in children. Review. Cancer metastasis reviews. 27 (4), 665-665 (2008).
- Corcoran, R. B., Bachar Raveh, T., Barakat, M. T. Insulin-like Growth Factor 2 Is Required for Progression to Advanced Medulloblastoma in patched1 Heterozygous Mice. Cancer research. 68 (21), 8788-8788 (2008).
- Gilbertson, R. J., Ellison, D. W. The Origins of Medulloblastoma Subtypes. Annual review of pathology. 3, 341-341 (2008).
- Ward, R. J., Lee, L., Graham, K. Multipotent CD15+ Cancer Stem Cells in Patched-1 Deficient Mouse Medulloblastoma. Cancer research. 69 (11), 4682-4682 (2009).
- Mao, J., Ligon, K. L., Rakhlin, E. Y. A Novel Somatic Mouse Model to Survey Tumorigenic Potential Applied to the Hedgehog Pathway. Cancer research. 66, 10171-10171 (2006).
- Han, Y. G., Kim, H. J., Dlugosz, A. A. Dual and opposing roles of primary cilia in medulloblastoma development. Nature medicine. 15 (9), 1062-1062 (2009).
