Isolamento, di arricchimento e manutenzione delle cellule staminali Medulloblastoma

Summary

Questo protocollo descrive l'isolamento, l'arricchimento e il mantenimento delle cellule tumorali medulloblastoma staminali derivate da topi mutanti con percorso di attività ectopica di Sonic hedgehog.

Abstract

Tumori del cervello sono state proposte di possedere una piccola popolazione di cellule staminali che sono la causa principale di tumorigenesi. Saggi neurosfere sono state generalmente adottate per studiare la natura delle cellule staminali neurali, compresi quelli derivati ​​da tessuti normali e tumorali. Tuttavia, quantità apprezzabili di differenziazione e morte cellulare sono comuni nelle neurosfere colto probabilmente dovuto alla non ottimale condizione come l'accessibilità di tutte le cellule all'interno degli aggregati sfera di terreno di coltura.

Medulloblastoma, il più comune tumore pediatrico sistema nervoso centrale, è caratterizzata da rapida progressione e la tendenza a diffondersi lungo l'intero cervello-spinale, con triste risultato clinico. Medulloblastoma è un tumore neuroepiteliale del cervelletto, che rappresentano il 20% e il 40% dei tumori intracranici e fossa posteriore durante l'infanzia, rispettivamente ^1. E 'ormai noto che Shh segnalazione stimola la proliferazione dei precursori neuronali dei granuli cerebellari (CGNPs) durante lo sviluppo del cervelletto ^2-4. Numerosi studi utilizzando modelli del mouse, in cui il percorso Shh è costitutivamente attivata, hanno collegato segnalazione Shh con medulloblastoma ^5-9.

Un recente rapporto ha mostrato che un sottogruppo di cellule derivate da medulloblastoma Patched1 topi ^{LacZ / +} sono le cellule staminali tumorali, che sono in grado di avviare e propogating tumori ^10. Qui si descrive un metodo efficace per isolare, arricchire e mantenere le cellule staminali tumorali derivanti da alcuni modelli murini di medulloblastoma, con costitutivamente attivato percorso Shh a causa di una mutazione in Smoothened ^(11, di cui esso contenute come SmoM2), un GPCR, che è fondamentale per Shh percorso di attivazione. In ogni tessuto medulloblastoma isolato, siamo stati in grado di stabilire numerose colonie altamente proliferative. Queste cellule robustamente espresso diversi marcatori di cellule staminali neurali come Nestin e Sox2, possono subire passaggi consecutivi (maggiore di 20) e sono stati clonogenica. Mentre queste colture di cellule staminali tumorali sono relativamente piccole, spesso bipoar nucleare con elevato rapporto citoplasmatico quando coltivate in condizioni favoriscono la crescita delle cellule staminali, hanno drasticamente modificato la loro morfologia, esteso più processi cellulari, appiattite e si ritirò dal ciclo cellulare dopo il passaggio a una cella mezzo di coltura supplementato con 10% di siero fetale bovino. Ancora più importante, queste cellule staminali tumorali differenziate in Tuj1 NeuN + + o neuroni, astrociti GFAP + e + CNPase oligodendrociti, evidenziando la loro multi-potenza. Inoltre, queste cellule erano in grado di propagare medulloblastomi secondario quando ortotopicamente trapiantate in topi di accoglienza.

Protocol

1. Micro-dissezione del tumore-cuscinetto Cervelletto, dissociazione del tessuto tumorale e placcatura Recupero del tessuto tumorale Sick topi portatori di medulloblastoma erano spesso runted, visualizzati idrocefalo e tipici sintomi neurologici, tra cui paralisi posteriore e l'incapacità di riacquistare la postura in caso di ribaltamento. Per recuperare tessuto tumorale, eutanasia topi per inalazione di anidride carbonica. E 'importante non eseguire dislocazione cervicale, una procedura che…

Discussion

Descriviamo un modo efficace per isolare, arricchire e mantenere le cellule staminali da medulloblastoma primario tessuto tumorale recuperato da topi mutanti con costitutivamente attiva di segnalazione Hedgehog. Abbiamo scoperto che un passo fondamentale in successo, che istituisce un sano linea di staminali delle cellule tumorali è il trattamento Accutase utilizzato durante la dissociazione del tessuto del tumore primario. Nella nostra esperienza, al momento della prima tessuto tumorale dissociare dal cervelletto, 4 m…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Neurobasal medium		Invitrogen	21103049
hEGF		Invitrogen	PHG0311	25ng/ml
bFGF		Invitrogen	PHG0023	25ng/ml
N2		Invitrogen	17502048	1X
B27(-RA)		Invitrogen	12587010	1X
Accutase		Invitrogen	A1110501	50%
Gelatin		Sigma	G1393	0.1%
Glutamine		Invitrogen	25030081	2mM
Primaria dishes		Fisher	087724C
Sox2 antibody		Millipore	MAB4343	Mouse, 1:1000
Nestin antibody		DSHB	rat401	Mouse, 1:200
YFP antibody		Molecular Probes	A11122	Rabbit, 1:2000
GFAP antibody		Neuromics	CH22102	Chicken, 1:1000
Tuj1 antibody		Sigma	T5076	Mouse, 1:2000
NeuN antibody		Millipore	MAB377	Mouse, 1:2000
CNPase antibody		Millipore	MAB326	Mouse, 1:1000